Adrenomedulina y pamp, nuevas dianas terapéuticas para el diseño deagentes antiproliferativos y/o antiangiogénicos

Resum

La Adrenomedulina (AM) y el péptido 20-N-terminal de la proadrenomedulina (PAMP) son dos péptidos biológicamente activos relacionados entre sí y que desarrollan papeles muy importantes en la regulación de diversas funciones biológicas. La AM es un factor vital para la supervivencia de las células tumorales ya que, además de comportarse como un factor de crecimiento, reduce la apoptosis, su producción aumenta en situaciones de hipoxia y muestra una acusada actividad proangiogénica en modelos ex vivo e in vivo. El PAMP es aún más potente como factor angiogénico y su inhibición provoca la reducción del crecimiento tumoral. En el presente trabajo nos hemos planteado la búsqueda de pequeñas moléculas que, a través de su unión a estos péptidos, puedan modular su actividad. Especial interés poseen los moduladores negativos, por su potencial utilidad como agentes antitumorales y/o antiangiogénicos. Para este estudio se han aplicado dos estrategias diferentes de diseño de fármacos. En el caso de la AM, al no disponer de la estructura tridimensional, se ha llevado a cabo un diseño basado en el ligando. Por el contrario, la disponibilidad de la estructura 3D del PAMP, ha permitido iniciar el estudio mediante un cribado virtual para detectar moléculas que se unan al péptido. En el capítulo I de esta memoria nos hemos centrado en la AM. En un estudio de cribado farmacológico puesto a punto en el Instituto Nacional del Cáncer de EEUU (NCI), se detectaron varios moduladores positivos y negativos de AM con una interesante actividad hipotensora y antiproliferativa, respectivamente. En primer lugar se puso a punto un método de síntesis para obtener una serie de compuestos estructuralmente relacionados con un cabeza de serie previamente seleccionado mediante el citado cribado farmacológico llevado a cabo en el NCI. A continuación, se evaluó cualitativamente la afinidad por la AM de los compuestos sintetizados mediante un estudio de competición con su anticuerpo monoclonal. También se estudió de forma cuantitativa, con la técnica de Resonancia de Plasma en Superficie (Surface Plasmon Resonance, SPR), la capacidad de unión de los compuestos a la AM. Los datos se utilizaron para establecer un modelo QSAR-3D que nos permitió identificar ciertas características estructurales fundamentales para la unión a la AM: la presencia de un grupo dador de enlace de hidrógeno y un anillo aromático. Además, el modelo posee una alta capacidad predictiva y está siendo utilizado para el diseño de nuevos moduladores más activos. En la siguiente etapa se determinó la producción de AMPc mediante un radioinmunoensayo, lo que nos permitió comprobar que los compuestos con un ácido carboxílico libre se comportan como moduladores negativos de la AM. Por lo tanto, todos los ácidos sintetizados se sometieron a ensayos de actividad antiproliferativa en diferentes líneas celulares. El compuesto 16, que es el que posee mayor afinidad por la AM, mostró una interesante actividad antiproliferativa frente a la línea celular de cáncer de colon HCT116, por lo que ha sido seleccionado para llevar a cabo ensayos in vivo en colaboración con el Centro Integral Oncológico Clara Campal (CIOCC), Hospital de Madrid. En el capítulo II de esta memoria, nos propusimos buscar pequeñas moléculas capaces de modular la acción del PAMP. En primer lugar, se llevó a cabo un cribado virtual, utilizando el programa AutoDock, de la colección de compuestos del NCI (NCI diversity set), constituida por 1800 compuestos, junto con 60 compuestos pertenecientes a nuestra quimioteca. Este cribado nos permitió seleccionar los 50 compuestos con mayor afinidad de acuerdo a criterios energéticos. A continuación se puso a punto un método para determinar experimentalmente la afinidad de los ligandos por el PAMP, basado en la competencia con un anticuerpo monoclonal antiPAMP. De esta forma se seleccionaron los 20 compuestos más afines para realizar otros ensayos biológicos y de afinidad. Con la finalidad de profundizar en el conocimiento de las interacciones que se establecen entre el péptido y un ligando que mostró afinidad por el PAMP mediante SPR, se llevaron a cabo simulaciones de Dinámica Molecular (DM) del complejo correspondiente y del péptido libre. La simulación puso de manifiesto que las interacciones que más contribuyen a la estabilidad del complejo son las interacciones de tipo catión-¿ entre argininas del péptido y anillos aromáticos del ligando y de apilamiento (stacking) entre anillos aromáticos de ambas especies. Aplicando los métodos MM-PBSA (Molecular Mechanics Poisson Boltzmann Surface Area) y MM-GBSA (Molecular Mechanics Generalized Born Surface Area) y el módulo NMODE de AMBER, se determinó la energía teórica de unión del complejo PAMP-USP1K (¿Gbind) y se comparó con la energía de unión calculada para el complejo entre el PAMP y un compuesto que experimentalmente se ha demostrado que no se une al péptido (PAMP-USP1N). Por otro lado, para el complejo PAMP-USP1K se calculó la contribución media de la entalpía de unión de cada uno de los residuos del péptido, confirmando la importancia de las interacciones detectadas en la simulación de dinámica molecular. Recientemente, se ha comenzado a estudiar la interacción de nuestros compuestos con PAMP utilizando técnicas de RMN. Esta técnica permite, no solo confirmar la formación de los complejos, sino también obtener información experimental sobre los residuos del péptido implicados en la unión, que podrían confirmar los datos obtenidos en nuestro estudio teórico. Finalmente, todos los compuestos que dieron positivo el ensayo de competición con el anticuerpo monoclonal antiPAMP fueron evaluados en un ensayo de anillos aórticos de pollo, para determinar su actividad antiangiogénica, pero desafortunadamente ninguno de ellos resultó activo. Sin embargo, tres de ellos han mostrado una interesante actividad antiproliferativa frente a la línea celular de cáncer de colon Caco-2.