Descubrimiento de nuevos marcadores biológicos implicados en inflamación alérgica mediante metabolómica

Resumen

La prevalencia y gravedad de las enfermedades alérgicas ha ido aumentado progresivamente en todo el mundo, hasta la fecha, los fenotipos de alergia respiratoria no están completamente caracterizados y, junto con la progresión de la inflamación, el tratamiento es cada vez más complejo y costoso. La sensibilización a profilina y la gravedad de la alergia alimentaria asociada a ella, proporciona un buen modelo para el estudio de la progresión de la inflamación alérgica. En los últimos años, el uso de las ciencias ómicas ha permitido obtener una visión global de los sistemas biológicos, cada enfoque ómico está especializado en la detección de un nivel específico de la biología de sistemas. En la presente tesis, se han aplicado la metabolómica y la proteómica a diferentes escenarios de alergia proporcionando una información complementaria muy valiosa. Por lo tanto, el objetivo principal de este trabajo ha sido la aplicación de la metabolómica para obtener el perfil metabólico en muestras de plasma combinando dos herramientas analíticas complementarias: cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). Para conseguir este objetivo se reclutaron veinticinco individuos (de 19 a 53 años). Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito, y los Comités de Investigación y Ética aprobaron el protocolo de los cuatro hospitales participantes. Estos pacientes han sido estudiados en detalle para el remodelado de la mucosa oral en un trabajo previo. De estos, seis sujetos no eran alérgicos y se incluyeron como controles. A todos los pacientes se les entrevistó para establecer su historia clínica. Los criterios de inclusión para pacientes alérgicos fueron los siguientes: una prueba de punción cutánea positiva para profilina, pero negativa para proteínas de transferencia de lípidos, llevada a cabo con extractos disponibles comercialmente e IgE específica positiva para profilina (> 0,35 kU/l), pero negativa para Pru p 3 y Bet v 1. Los pacientes se sometieron a una provocación oral utilizando un extracto puro de profilina. El estado clínico de los pacientes se determinó en base a su historial clínico de alergia alimentaria y al resultado de la provocación oral. Los pacientes que sufrieron reacciones sistémicas y que afectaron a varios órganos, como urticaria y asma, fueron fenotipados como "pacientes graves con alergia a profilina" y los pacientes que presentaron reacciones locales o subjetivas durante la provocación, como el síndrome de alergia oral (SAO), angioedema o prurito oral, se consideraron "pacientes no graves alérgicos a profilina ". Las muestras de sangre se extrajeron antes de la provocación oral con profilina. Se recogieron 20 ml de sangre periférica para obtener plasma por centrifugación y PBMCs (células mononucleares de sangre periférica) utilizando una centrifugación en gradiente de densidad, Ficoll-Paque. Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta la realización del análisis metabolómico. Los perfiles metabólicos de las muestras de plasma se obtuvieron utilizando LC-MS y GC-MS. Inicialmente, se obtuvieron 615 y 506 señales químicas en LC-MS en ionización positiva (LC-MS+) y negativa (LC-MS-), respectivamente, de las cuales 349 y 400 señales cumplieron con los criterios de calidad. Además, se obtuvieron 95 metabolitos por muestra mediante GC-MS. La calidad de los datos se evaluó mediante la agrupación de las medidas del control de calidad (QC) en un modelo no supervisado, utilizando el análisis de componentes principales (PCA), para las tres técnicas. Se examinaron las tendencias para todas las muestras utilizando modelos PCA de las tres técnicas y no mostraron una agrupación clara de los pacientes de acuerdo con su estado clínico. Por lo tanto, se decidió comparar los casos más extremos, es decir, los individuos con un claro estado clínico, los "no alérgicos" y los "pacientes con alergia grave a profilina", para buscar las diferencias entre estos grupos utilizando un análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA). Por lo tanto, para obtener las diferencias exclusivamente según la clase, se realizó un modelo de análisis discriminante por mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) seleccionando el mejor modelo PLS-DA de los tres conjuntos de datos. El modelo de LC-MS+ mostró los mejores parámetros de calidad. El modelo de validación cruzada del OPLS-DA mostró también parámetros de buena calidad (R2 = 0.99, Q2 = 0.75) y fue validado utilizando el enfoque de " validación cruzada dejando uno fuera ", mostrando una precisión de predicción del 92%. Este modelo se utilizó para asignar una clase al grupo de "pacientes no graves alérgicos a profilina ". En consecuencia, las muestras de este grupo se estratificaron en: "no alérgicos", "leves", "moderados" y "graves". En resumen, el modelo permitió la clasificación de los "pacientes no graves alérgicos a la profilina" que no pudieron clasificarse adecuadamente mediante la provocación oral. Para los datos de LC-MS, se utilizó la transformación logarítmica y el escalado centrado, mientras que para GC-MS, se aplicó el autoescalado (UV) a todas las variables. La robustez de los modelos se evaluó en base a los parámetros R2 (capacidad de clasificación) y Q2 (capacidad de predicción). Después, las muestras se representaron de acuerdo con su clasificación metabólica utilizando un modelo de PCA, mostrando una clara tendencia a separar el grupo "leve" de los grupos "grave" y "moderado". Además, con el objetivo de mostrar las diferencias entre los grupos, se realizó un análisis discriminante utilizando PLS-DA para cada par de grupos. Los resultados produjeron al menos un modelo para cada comparación con parámetros de alta calidad. Estos resultados demostraron que existen diferencias metabólicas entre los grupos. Tras realizar el análisis multivariante, las variables significativas se seleccionaron mediante análisis univariante. En general, los resultados sugirieron que hay características específicas que pueden caracterizar cada fenotipo, especialmente al grupo "grave". Una vez que se encontraron las entidades significativas en LC-MS, se realizó la anotación mediante fragmentación por MS/MS y la identificación por patrón en aquellos metabolitos que contaron con un estándar comercial. Junto con los metabolitos de GC-MS, se encontraron un total de 74 compuestos, que incluyen carbohidratos, esfingolípidos, lisofosfolípidos, carnitinas, aminoácidos, ácidos grasos y ácidos orgánicos. Las diferencias entre los grupos experimentales se analizaron utilizando el test estadístico no paramétrico de Kruskal-Wallis con una corrección de Benjamini-Hochberg (BH) para identificar posibles biomarcadores. Además, se añadieron las diferencias significativas entre las comparaciones de "leve frente a grave" y "moderado frente a grave" obtenidas mediante la prueba U de Mann Whitney con una corrección del p valor BH, para mejorar la interpretación biológica. La significación estadística se estableció en un nivel del 95% (p <0.05). Los cambios generales observados en el grupo "grave" fueron los siguientes: una disminución de los niveles de hexosas, pentosas, piruvato y esfinganina-C17; un aumento junto con la gravedad en los niveles de la mayoría de las lisofosfocolinas (LPC), S1P, esfinganina-1-fosfato y lactato. Además, los ácidos grasos como el ácido mirístico y el ácido láurico disminuyeron en "leve" y "moderado", y aumentaron en el grupo "grave". En conjunto, estos resultados apuntan a una alteración del metabolismo energético, así como a cambios en las rutas de esfingolípidos y lisofosfolípidos. Por otro lado, y como objetivo adicional de esta tesis, se utilizó proteómica para desarrollar y optimizar un método para cuantificar en un solo tubo, la cinética completa de los diferentes anticuerpos específicos de alérgeno. Además, este método se aplicó en muestras de suero de pacientes alérgicos tratados con dos tipos de inmunoterapia (sublingual y subcutánea). El método fue optimizado y se aplicó con éxito en las muestras del ensayo clínico. Después de analizar la cinética de la IgE e IgG4 en los dos tipos de inmunoterapia utilizando este método, se comprobó que los resultados obtenidos por el método tradicional utilizando immunoCAP estaban en concordancia.