Splicing alternativo y quimerismo en genes del MHC de clase III: relación de esta región con la Artritis Reumatoide

Resumen

Post-transcriptional regulations such as Alternative Splicing (AS) and Transcription Induced Chimerism (TIC) are mechanisms that expand transcriptome and proteome diversity in higher eukaryotes. These mechanisms allow the generation of different RNAs and multiple protein isoforms. Several Major Histocompatibility Complex (MHC) class III genes, such as the Receptor for Advanced Glycosylation End Product (RAGE) gene and the G6F and Leukocyte antigen LY6G6D genes, have been previously studied in relation to these mechanisms at RNA level, as well as some isoforms encoded by them. Moreover, this region has been related to several diseases, including Rheumatoid Arthritis (RA), although these associations have not been fully studied. In this study we examined in detail the different RAGE, G6F, LY6G6D and chimera G6F-LY6G6D mRNAs generated by both AS and/or chimerism on different mammals from different tissues and development stages, as well as in tumor samples. By nested RT-PCR, we identified a high number of different splice variants including non-coding and predicted coding ones. In addition, the two different chimera transcripts, found between the G6F and LY6G6D genes, were conserved among mammals presenting also AS in the analysed tissues. However, analysis of RNA-seq data enabled the detection of the most abundant RAGE splice variants only when default Cufflinks parameters were altered and none of the chimera transcrips were detected, probably due to the low expression of these three genes. Over-expression of some of these protein isoforms have indicated that differences in the protein domains affect their post-translational modifications, their subcellular localization and possibly the potential ligand binding and intracellular signaling of the studied receptors. In addition, we have been able to detect the formation of G6F and lgch heterodimers when both proteins were over-expressed. In the other hand, none of these studied splice events presented an altered expression levels when RNA samples from RA patients were analyzed by nano-quantitative RT-PCR. On the contrary, the expression levels of some other MHC III genes were found altered using this method in these same RA samples compared to healthy samples, or even between samples from RA patients with the disease in remission or active. In conclusion, alternative splicing and chimerism are involved in the generation of a considerable RNA and protein diversity of RAGE, G6F and LY6G6D genes in different tissues and mammalian species. Las regulaciones post-transcripcionales tales como splicing alternativo (AS) y quimerismo (TIC) son mecanismos que expanden la diversidad transcriptómica y proteómica en eucariotas superiores. Estos mecanismos permiten la generación de diferentes RNAs y múltiples isoformas proteicas. Se han estudiado previamente diversos genes localizados en el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase III, tales como el gen Receptor de Agentes de Glicosilación Avanzada (RAGE) y los genes G6F y LY6G6D, en relación a estos mecanismos al nivel de RNA, así como algunas isoformas codificadas por ellos. Además, esta región ha sido relacionada con varias enfermedades, entre las que se incluye la artritis reumatoide (RA), aunque estas asociaciones no han sido detalladamente estudiadas. En este estudio hemos examinado en detalle los diferentes mRNAs de RAGE, G6F, LY6G6D y de la quimera G6F-LY6G6D que han sido generados por AS y/o por quimerismo en diferentes tejidos y estadios de desarrollo, así como en muestras de tumores, en diferentes mamíferos. Por RT-PCR anidada, hemos identificado un elevado número de variantes de splicing diferentes, entre las que se incluyen no codificantes y potencialmente codificantes según predicciones bioinformáticas. Además, se encontraron dos tipos diferentes de transcritos quiméricos entre los genes G6F y LY6G6D, los cuales estaban conservados en mamíferos y presentaban también eventos de AS en los tejidos analizados. Sin embargo, los análisis de los datos de RNA-seq permitieron solo la detección de las variantes de splicing más abundantes de RAGE cuando los parámetros por defecto de Cufflinks fueron alterados, en cambio no fue detectado ninguno de los transcritos quiméricos, posiblemente debido a los bajos niveles de expresión de estos genes. La sobreexpresión de alguna de estas isoformas ha indicado que las diferencias en los dominios proteicos afecta tanto las modificaciones post-traduccionales de las isoformas resultantes, como a su localización y posiblemente la unión por su potencial ligando potencial y la señalización intracelular de los receptores estudiados. Además, hemos sido capaces de detectar la formación de heterodímeros entre la proteína canónica G6F y la proteína quimérica lgch cuando ambas proteínas eran sobre-expresadas. Por otro lado, ninguno de los eventos de splicing estudiados presenta unos niveles de expresión alterados cuando analizamos muestras de RNA de pacientes con RA por nanotecnología de RT-PCR cuantitativa. Por el contrario, usando este método encontramos alterados en estas muestras de RA los niveles de expresión de otros genes localizados en el MHC de clase III, o incluso entre muestras de pacientes con AR con la enfermedad en remisión o activa. Para concluir, el splicing alternativo como los fenómenos de quimerismo se han visto involucrados en la generación de una gran diversidad a nivel de RNA y de proteína tanto en RAGE como en G6F, LY6G6D y G6F-LY6G6D en diferentes tejidos y especies