Superenrollamiento, encadenamiento y anudamiento del DNA en procariotas y ecuariotas

Resum

En la presente tesis hemos analizado diferentes aspectos de la topología del DNA en bacterias y levaduras. Para optimizar la separación de topoisómeros de DNA plasmídico de igual masa total pero que difieren en su grado de superenrollamiento, encadenamiento o anudamiento, variamos sistemáticamente las condiciones de electroforesis bidimensional en geles de agarosa. Las diferencias observadas nos permiten mejorar las condiciones para su identificación y separación. También abordamos la dinámica de la topología del DNA durante la replicación, concretamente, el posible giro de las horquillas durante la replicación y la consecuente formación de pre-encadenados. Una vez aislado el DNA, las horquillas pueden girar libremente in vitro permitiendo la difusión de la tensión torsional de la región no replicada a la ya replicada (y viceversa) logrando un equilibrio termodinámico. Examinamos los intermediarios de replicación (RIs) de tres plásmidos bacterianos con la horquilla detenida en diferentes posiciones y aislados de células con la Topoisomerasa IV (Topo IV) activa o inactiva in vivo. Los resultados obtenidos indican que los RIs están más torsionados cuando se aíslan de células sin Topo IV. Esta observación sugiere que las horquillas giran in vivo dando lugar a la formación de pre-encadenados a lo largo de la replicación. Finalmente, estudiamos los intermediarios y productos de replicación de minicromosomas artificiales de levaduras (YACs) circulares y lineales en presencia y en ausencia de la Topoisomerasa 2 (Topo 2). Los resultados obtenidos confirman que en ausencia de Topo 2 los YACs circulares se acumulan en forma de encadenados mientras que los YACs lineales son capaces de replicar y segregar. Los patrones de los RIs de los YACs circulares y lineales mostraron diferencias significativas que indican que el superenrollamiento del DNA podría desempeñar un papel clave en la modulación de la progresión de las horquillas de replicación.