Advanced technologies to obtain functional ingredients from shiitake mushrooms (lentinula edodes)

Resumen

Nowadays, consumption of edible mushrooms is encouraged by nutritionists and health-caring authorities, not only because of their culinary and nutritive value but also because they contain bioactive molecules that can be beneficial for human health. Shiitake mushrooms (Lentinula edodes) deserve special attention since they showed a wide diversity of health-promoting activities such as hypocholesterolemic, immunomodulatory, antioxidant, antitumoral, antihypertensive, etc. These biological properties were related with specific compounds e.g. fungal sterols (ergosterol and derivatives), polysaccharides (α- and β-D-glucans, chitins, etc.), proteins/peptides and secondary metabolites (phenolic compounds, eritadenine, lenthionine, etc.). Therefore, the aim of this PhD thesis was to evaluate the use of several advanced extraction technologies that can be up-scaled and sequentially applied or combined to obtain functional ingredients from shiitake mushrooms to design novel functional foods. Supercritical CO2 (SFE) procedures at pilot and larger scales were adjusted to obtain fungal sterols-enriched extracts. These extracts could be transformed into ergocalciferol-enriched fractions (vitamin D2) by submitting them to UV-irradiation. The supercritical extracts contained up to 53% ergosterol and they were able to displace cholesterol from dietary mixed micelles using an in vitro digestion model. They were also effective when the extracts were microemulsified and mixed with fungal β-D-glucans. However, when the extracts were administered to mice, serum cholesterol levels were not significantly lowered. An eritadenine-enriched extract was easily obtained with conventional methods from shiitake mushrooms but also from other mushrooms species e.g. Marasmius oreades. This metabolite was partially degraded by conventional cooking technologies and scavenged by modern culinary texturizers being grilling and gelling the treatments that improved its bioaccesibility. When rats were fed the extract (21 mg/kg/day) for 35 days, eritadenine was detected in rats liver indicating that it was bioavailable and no organ damage or metabolic disorder was noticed while the atherogenic index (total cholesterol/HDL-cholesterol) was reduced. Shiitake β-D-glucans, chitins and other water soluble polysaccharides were extracted using microwave-assisted (MAE), ultrasound-assisted (UAE) and subcritical water extractions (SWE) as well as a solid/liquid extraction unit coupled to pressure-driven crossflow filtration membranes. SFE and combinations of the indicated technologies were also tested to improve polysaccharides extractions. A response surface study indicated that the highest polysaccharide yield obtained from shiitake using MAE was 9.2%. According to fluorimetric determinations, the obtained extracts contained (1→3)-β-D-glucans but they could not be properly quantified because according to NMR analysis, the extracts contained other polysaccharides that might interfere with the fluorophore used for their determination (depending on the mushroom species). UAE and SWE extractions showed similar yields (6.1 and 11.3%) and also contained (1→3)-β-D-glucans and (1→3),(1→6)-β-D-glucans but combinations of SFE+UAE, SFE+SWE or UAE+SWE were more effective for polysaccharide extractions yielding up to 17.2% of polysaccharides. The latter extracts showed in vitro ability to inhibit the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR), the key enzyme in the endogenous cholesterol biosynthesis. They also decreased the secretion of pro-inflammatory cytokines in LPS-activated macrophages (THP-1 cells) acting as immunomodulatory extracts. Moreover, high amounts of a hot water soluble β-D-glucan-enriched extract were prepared using a pilot scale solid/liquid reactor and after testing microfiltration, nanofiltration and reverse osmosis. The filtration membrane showing higher filtration flux and values of bioactive compounds in the obtained extract was Nanomax50. In addition, 3 particular glucans were also isolated from the fraction remaining in the reactor because they showed HMGCR inhibitory and antioxidant capacities, as well as immunomodulatory and antitumoral properties tested in cell cultures. Therefore, both hot water and insoluble fractions were pooled together and mixed with a cold water soluble fraction (containing eritadenine and water-soluble β-D-glucans) and their hypocholesterolemic activity was tested in vitro and in vivo. The so called β-D-glucan-enriched (BGE) mixture showed the ability to displace cholesterol from dietary mixed micelles and inhibit HMGCR in vitro and it also lowered cholesterol levels in serum of hypercholesterolemic mice when administrated for 5 weeks. Thus, a sequential extraction procedure was designed to obtain several bioactive fractions from the same shiitake batch. The generated fractions contained different levels of bioactive compounds such as ergosterol, eritadenine, β-D-glucans, chitins, hypotensive peptides, antioxidant phenols and anti-thrombotic lenthionine. The protocol combined 3 scalable methods using the material remaining after one extraction to generate other fractions. Finally, a randomized, controlled, double-blind, and parallel clinical trial was carried out with 52 subjects with not treated mild hypercholesterolemia that consumed the BGE mixture or a placebo incorporated in 3 different commercial creams. After 8 weeks intervention, no significant lowering cholesterol levels nor modulation of the immune system were noticed. However, consumption of the BGE mixture was safe, volunteers achieved the dietary fiber intake recommended by authorities as cardiovascular protective diet and their colonic microbiome was differently modulated compared to placebo. Some genera positive- or negatively correlated with biomarkers related to cholesterol homeostasis. Nevertheless, the precise significance of this differential modulation could not be fully elucidated. Perhaps, longer intervention time was needed to achieve statistical significances. En la actualidad, el consumo de hongos comestibles es recomendado por nutricionistas y autoridades sanitarias, no solo por su valor culinario y nutricional sino también por su contenido en moléculas bioactivas que pueden resultar beneficiosas para la salud humana. La seta shiitake (Lentinula edodes) merece especial atención, ya que presenta una gran diversidad de actividades, tales como hipocolesterolémica, inmunomodulatoria, antioxidante, antitumoral, antihipertensiva, etc. Estas propiedades biológicas se han relacionado con compuestos específicos, por ejemplo esteroles fúngicos (ergosterol y derivados), polisacáridos (α- y β-D-glucanos, quitinas, etc.), proteínas/péptidos y metabolitos secundarios (compuestos fenólicos, eritadenina, lentionina, etc.). Por ello, el objetivo de esta tesis doctoral fue evaluar el empleo de diferentes tecnologías avanzadas de extracción que pudieran ser escalables y aplicables de forma secuencial o combinadas para obtener ingredientes funcionales a partir de setas shiitake que puedan dar lugar al diseño de nuevos alimentos funcionales. Se ajustaron procedimientos utilizando CO2 supercrítico (SFE) a escala piloto y gran escala para obtener extractos ricos en esteroles fúngicos. Estos extractos pudieron transformarse en fracciones ricas en ergocalciferol (vitamina D2) sometiéndolos a radiación UV. Los extractos supercríticos contenían hasta un 53% de ergosterol y lograron desplazar el colesterol de las micelas mixtas de la dieta utilizando un modelo de digestión in vitro. También fueron efectivos cuando se microemulsificaron y cuando se mezclaron con β-D-glucanos fúngicos. Sin embargo, cuando los extractos fueron administrados a ratones, no redujeron significativamente sus niveles séricos de colesterol. Se obtuvo un extracto rico en eritadenina mediante el empleo sencillo de métodos convencionales a partir de setas shiitake pero también a partir de otras especies de setas, por ejemplo, Marasmius oreades. Este metabolito fue parcialmente degradado por las tecnologías de cocina convencional y secuestrado por los texturizadores utilizados en la cocina moderna, siendo el cocinado a la plancha y la gelificación los tratamientos que mejoraron su bioaccesibilidad. Cuando el extracto fue administrado a ratas (21 mg/kg/día) durante 35 días, se detectó eritadenina en el hígado de las ratas, indicando que era biodisponible. Además, no se observaron daños en ningún órgano ni ningún desorden metabólico, mientras que se redujo el índice aterogénico (colesterol total/colesterol-HDL). Se extrajeron β-D-glucanos, quitinas y otros polisacáridos solubles en agua utilizando extracciones asistidas por microondas (MAE), por ultrasonidos (UAE) y extracciones con agua subcrítica (SWE), así como a través de una unidad de extracción sólido/líquido acoplada a un equipo de filtración tangencial por membranas impulsado a presión. Se evaluaron las técnicas de SFE y las combinaciones de las tecnologías indicadas para mejorar la extracción de polisacáridos. Un estudio de superficie de respuesta indicó que el mayor rendimiento de polisacáridos que se obtuvo utilizando MAE fue del 9,2%. De acuerdo con las determinaciones fluorimétricas, los extractos obtenidos contenían (1→3)-β-D-glucanos, aunque estos no pudieron ser cuantificados apropiadamente, ya que, según los análisis de resonancia magnética nuclear, los extractos contenían otros polisacáridos que podrían interferir con el fluoróforo utilizado para su determinación (dependiendo de la especie de seta). Las extracciones UAE y SWE mostraron rendimientos similares (6,1 y 11,3%), conteniendo también (1→3)-β-D-glucanos y (1→3),(1→6)-β-D-glucanos, pero las combinaciones de SFE+UAE, SFE+SWE o UAE+SWE fueron más efectivas para la extracción de polisacáridos alcanzando rendimientos de hasta el 17,2%. Estos últimos extractos mostraron la habilidad de inhibir in vitro la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMGCR), la enzima clave en la biosíntesis endógena de colesterol. También redujeron la secreción de citoquinas pro-inflamatorias por parte de macrófagos activados con LPS (células THP-1), actuando como extractos inmunomodulatorios. Además, se prepararon grandes cantidades de extractos solubles en agua caliente ricos en β-D-glucanos, a través del uso de un reactor sólido/líquido a escala piloto y después de evaluar el empleo de técnicas de microfiltración, nanofiltración y ósmosis inversa. La membrana Nanomax50 fue la que mostró un mayor flujo de filtración y los valores más altos de compuestos bioactivos en el extracto obtenido. Por otra parte, tres glucanos concretos fueron aislados de la fracción remanente en el reactor, puesto que mostraron capacidad inhibidora de la HMGCR y antioxidante, así como propiedades inmunomodulatorias y antitumorales estudiadas en cultivos celulares. Por ello, tanto las fracciones solubles e insolubles en agua caliente fueron mezcladas junto con una fracción soluble en agua fría (que contenía eritadenina y también β-D-glucanos solubles en agua) y se evaluó la actividad hipocolesterolémica de la mezcla, tanto in vitro como in vivo. La mezcla llamada extracto rico en β-D-glucanos (BGE) mostró la capacidad para desplazar el colesterol de las micelas mixtas de la dieta y para inhibir la HMGCR in vitro y también redujo los niveles de colesterol sérico de ratones hipocolesterolémicos tras su administración durante 5 semanas. Entonces, un procedimiento de extracción secuencial fue diseñado para obtener varias fracciones bioactivas del mismo lote de shiitake. Las fracciones generadas contenían diferentes niveles de compuestos bioactivos como ergosterol, eritadenina, β-D-glucanos, quitinas, péptidos hipotensivos, fenoles antioxidantes, lentionina antitrombótica. El protocolo combinó tres métodos escalables que utilizaban el material remanente después de una extracción para generar otras fracciones. Finalmente, un ensayo clínico aleatorizado, controlado, doble ciego y paralelo fue llevado a cabo en 52 sujetos con hipercolesterolemia moderada y no tratada que consumieron la mezcla BGE o un placebo incorporados en tres cremas comerciales diferentes. Después de 8 semanas de intervención, no se detectó reducción en los niveles de colesterol ni modulación del sistema inmune de los pacientes. No obstante, el consumo de la mezcla BGE fue seguro, los voluntarios alcanzaron la ingesta de fibra dietética recomendada por las autoridades para una dieta cardiosaludable y su microbioma colónico fue modificado de forma diferente en comparación con el placebo. Se pudieron establecer diversas correlaciones positivas y negativas entre los distintos géneros y los marcadores biológicos relacionados con la homeostasis de colesterol. Sin embargo, el significado preciso de esta modulación diferencial no pudo ser completamente dilucidado. Es posible que se requiera un mayor tiempo de intervención para lograr diferencias estadísticamente significativas.