Enzimas fúngicas implicadas en la síntesis y modificación de compuestos de interés aplicado

Resumen

Resumen Los organismos objeto de estudio de esta Tesis se engloban dentro del grupo de los hongos filamentosos. En concreto, el trabajo se ha centrado en Neurospora crassa, especie destacada por su uso como modelo genético para el abordaje de problemas biológicos básicos, y dos especies del género Fusarium, de gran interés como modelos de hongos fitopatógenos o como hongos productores de metabolitos con aplicaciones biotecnológicas. Entre ellos merecen especial atención fitohormonas, como las giberelinas, pigmentos, como los carotenoides, y micotoxinas, como las bicaverinas y las fusarinas. Los carotenoides, poseen propiedades beneficiosas para la salud y tienen importantes aplicaciones en la industria alimentaria y cosmética. Estos pigmentos son producidos tanto por Fusarium como por Neurospora, cuyas rutas biosínteticas comparten la síntesis de neurosporaxantina, una xantofila cuyo interés biotecnológico es actualmente objeto de estudio. En los últimos años, el grupo de investigación en el que se ha desarrollado la Tesis ha contribuido a identificar los genes y enzimas responsables de la ruta biosintética de neurosporaxantina en Fusarium, y de las últimas reacciones en Neurospora, así como la caracterización de una ruta lateral en Fusarium de producción de retinal, apocarotenoide usado como cromóforo por las rodopsinas. Este trabajo describe el estudio de varios genes y enzimas implicadas en la síntesis y modificación de diferentes metabolitos de interés aplicado de ambos organismos. Para ello se han combinado técnicas bioquímicas, como son la expresión heteróloga de proteínas, los ensayos enzimáticos, y el análisis cromatográfico y espectrofotométrico de los compuestos sintetizados, con técnicas de Genética molecular, como son la mutagénesis dirigida y el análisis de la expresión génica. Estos enfoques experimentales se han completado con el análisis de las repercusiones fisiológicas de las modificaciones bioquímicas y genéticas en los hongos objeto de estudio. Se resumen a continuación los objetivos y resultados obtenidos Objetivo 1. Determinar el posible papel de la oxigenasa de carotenoides CAO-1 en la biosíntesis retinal en Neurospora crassa. Resultados: La enzima CAO-1 no es activa frente a carotenoides, por lo que no cabe atribuirle un papel en la producción de retinal en Neurospora crassa. Sin embargo, CAO-1 degrada resveratrol y otro estilbeno similar, y los niveles de ARNm de su gen aumentan considerablemente en presencia de resveratrol, por lo que el papel biológico de CAO-1 puede ser la degradación de esta fitoalexina en los hábitats naturales del hongo. Neurospora crassa muestra una baja sensibilidad a resveratrol. Los mutantes nulos cao-1 no muestran mayor sensibilidad que la estirpe silvestre, y en algunas condiciones de cultivo incluso crecen mejor en presencia de este compuesto, posiblemente por toxicidad leve sobre la estirpe silvestre de los productos de su degradación. Objetivo 2. Investigar la interdependencia entre los dominios ciclasa y sintasa de fitoeno en la enzima bifuncional AL-2 en Neurospora crassa. Resultados: La secuenciación de alelos mutados del gen al-2 de Neurospora crassa y su correlación con el contenido de carotenoides in vivo reveló mutaciones nulas y rezumantes en el dominio sintasa de fitoeno en las estirpes albinas, y mutaciones en el dominio ciclasa en una estirpe pigmentada. Uno de los mutantes de fenotipo nulo posee una inserción en al-2 que da lugar a una versión truncada del dominio sintasa de fitoeneo. A pesar de conservar íntegro su dominio ciclasa, el mutante carece de ambas actividades enzimáticas, sugiriendo una interdependencia estructural entre ambos dominios proteicos y su funcionamiento como un único polipéptido. Los mutantes nulos al-2 poseen cantidades pequeñas pero apreciables de un carotenoide, cuyas propiedades cromatográficas y espectrofotométricas sugieren que es diapolicopeno. La presencia de este carotenoide se explica por la actividad de la desaturasa AL-2 sobre el precursor de los esteroles, el escualeno. Este resultado sugiere que AL-2 puede ser también activa sobre geranilgeraniol, sugiriendo una posible vía alternativa para síntesis de retinal que no necesitaría la participación de una oxigenasa de carotenoides. Objetivo 3. Identificar y caracterizar la enzima responsable del último paso de la ruta biosintética de la neurosporaxanthin en Fusarium fujikuroi. Resultados. El gen carD de F. fujikuroi determina una deshidrogenasa de aldehído ortóloga de YLO-1 de Neurospora crassa. In vitro, la enzima CarD convierte ß apo 4' carotenal en neurosporaxantina, el producto final de la ruta carotenogénica en este hongo. CarD es activa sobre otros apocarotenales, pero no sobre retinal. Los mutantes carD acumulan ß-apo-4'-carotenal en lugar de neurosporaxantina, ambos con características colorimétricas similares. Sin embargo, el color del micelio de los mutantes experimenta un viraje paulatino hacía el amarillo a medida que aumenta el tiempo de incubación. El análisis químico de los carotenoides acumulados muestran la conversión gradual de ß-apo-4'-carotenal en ß-apo-4'-carotenol y, posiblemente, en derivados esterificados. En contraste con otros genes de la carotenogénesis de F. fujikuroi, los niveles de ARNm del gen carD aumentan solo levemente tras exposición a la luz. Sin embargo, los mutantes carS muestran aumentos significativos en dichos niveles, tanto en luz como en oscuridad, indicando que todos los genes de la ruta están sometidos al control negativo ejercido por la proteína CarS. Objetivo 4. Comprobar la posible formación de ácido retinoico a partir de retinal en Fusarium verticillioides y su hipotética función biológica. Resultados. El genoma de Fusarium verticillioides posee los mismos genes de la carotenogénesis que Fusarium fujikuroi. Ambas especies comparten también la inducción de la ruta por la luz, pero presentan diferencias en las cantidades de carotenoides acumuladas y en los niveles de ARNm de los genes estructurales. Se ha ensayado la actividad de oxidación de retinal de cinco enzimas de Fusarium verticillioides con similitud a deshidrogenasas de retinal de mamíferos. Una de ellas, la que muestra más similitud de secuencia y que hemos denominado CarY, convierte eficazmente retinal en ácido retinoico. La pérdida del gen carY en Fusarium verticillioides da lugar a alteraciones morfológicas respecto a la estirpe silvestre, incluyendo una drástica disminución en el número de peritecios cuando el mutante actúa como hembra en cruzamientos con una estirpe de sexo contrario. El fenotipo mutante es complementado por el alelo carY silvestre, sugiriendo que el ácido retinoico es un morfógeno en el desarrollo de este hongo. Objetivo 5. Identificar el gen PKS responsable de la biosíntesis de fusarina en Fusarium fujikuroi e investigar su regulación transcripcional. Resultados. Se ha identificado el gen fusA de Fusarium fujikuroi, que determina la sintetasa de policétidos responsable de la síntesis de fusarinas. Los mutantes nulos fusA no producen fusarinas, y carecen por tanto de la típica pigmentación amarillo anaranjada en las condiciones de cultivo en las que la estirpe silvestre produce esta micotoxina. Además, los mutantes poseen menor capacidad de degradación de celofán. Al contrario que la producción de otros metabolitos, la síntesis de fusarinas en Fusarium fujikuroi disminuye en ausencia de fuente de nitrógeno, resultado que correlaciona con una patente disminución en el contenido de ARNm del gen fusA. La incubación en la luz afecta también negativamente a la cantidad de fusarinas en el medio, pero este efecto se atribuye más a fotosensibilidad de estos compuestos que a un mecanismo de regulación de su síntesis.