Caracterización genética y molecular de los mutantes transcurvata de arabidopsis thaliana

Zusammenfassung

Las hojas del tipo silvestre Landsberg erecta de Arabidopsis son casi totalmente planas. Las de los mutantes transcurvata (tcu), que fueron aislados en el laboratorio de J.L. Micol tras una mutagénesis con metanosulfonato de etilo, se recurvan hacia el envés oblicuamente a la vena primaria, un rasgo fenotípico que les hace candidatos a estar alterados en algún gen implicado en la especificación y/o el mantenimiento de la simetría bilateral de las hojas, motivo por el que han sido estudiados en esta Tesis. En el mutante tcu1-1 se reduce el tamaño del limbo y el número de las células del mesófilo en empalizada de las hojas vegetativas, y se incrementa la longitud del hipocotilo y los peciolos y de las células de ambos. Manifiesta floración temprana e hipersensibilidad a la auxina sintética 2,4-D y al paclobutrazol, un inhibidor de la síntesis de giberelinas. Hemos establecido mediante clonación posicional que el gen TCU1 es At4g37130, confirmando su identidad mediante la obtención de 4 alelos insercionales de dominio público, cuyos fenotipos fueron similares al de tcu1-1, y los correspondientes ensayos de complementación. TCU1 codifica una nucleoporina presuntamente ortóloga de la Nup58 de los vertebrados y la levadura. El alelo tcu1-1 es portador de una transición C¿T que introduce un codón de terminación prematura que impide la traducción de 452 de los 513 aa de TCU1 (NUP58), lo que sugiere su naturaleza nula. La viabilidad de tcu1-1 indica que el gen TCU1 no es esencial, a pesar de ser de copia única. Hemos construido transgenes TCU1pro:TCU1, 2¿35Spro:TCU1 y TCU1pro:TCU1: GFP, cuya transferencia a plantas tcu1-1 restableció completamente el fenotipo silvestre. Ni la expresión constitutiva de TCU1 ni la de tcu1-1 causaron efecto fenotípico alguno en las plantas silvestres. Los transgenes TCU1pro:GUS y TCU1pro:TCU1:GFP nos han permitido establecer que el gen TCU1 se expresa en todos los órganos estudiados y que la proteína TCU1 se localiza en la envoltura nuclear, tal como cabría esperar de una nucleoporina. TCU1 parece contribuir menos que otras nucleoporinas a la exportación del ARNm del núcleo al citoplasma, ya que los alelos tcu1 más extremos alteran solo levemente la distribución subcelular del ARN poliadenilado. Empleando el método del doble híbrido de levadura, hemos realizado un escrutinio de genotecas de ADNc y varios ensayos dirigidos, que han revelado interacciones físicas entre TCU1 y varias nucleoporinas, importinas y exportinas, entre otras proteínas. Estos resultados son coherentes con los que hemos obtenido del análisis de los fenotipos de los dobles mutantes en los que hemos combinado tcu1-1 y tcu1-2 con otras mutaciones de insuficiencia de función. Considerados en conjunto, nuestros resultados indican que TCU1 forma parte del complejo del nucleoporo de Arabidopsis, en el que interacciona con nucleoporinas de los subcomplejos Nup107-160 (NUP96 y NUP160) y Nup62 (NUP54 y NUP62). Probablemente forma parte de este último, como sus presuntas ortólogas de la levadura y los vertebrados. TCU1 parece necesaria para la percepción de la luz, dado que los mutantes tcu1 manifiestan constitutivamente el síndrome de huida de la sombra, que se suprime cuando se incrementa la intensidad de la luz a la que son cultivados. TCU1 también parece relacionada con la ubiquitinación: interacciona con ASK1 (ARABIDOPSIS SKP1-LIKE1) y ASK2, dos componentes de los complejos SCF (LIGASA DE UBIQUITINA SKP1-CULINA/CDC53-F-BOX); y se comporta como un regulador negativo de la ubiquitinación, tal como se deduce de los niveles de proteinas ubiquitinadas en los mutantes tcu1, que son superiores a los silvestres. Además, hemos demostrado que NUP54 y NUP62 interaccionan entre sí y con ASK2. También hemos comenzado el estudio de la estirpe que inicialmente llamamos tcu2-1, que ha resultado ser portadora de dos mutaciones en genes ligados, separados por unos 30 cM: tcu2-1 en TCU2 y zll-2 (zwille-2) en AGO10 (ARGONAUTE10). El gen AGO10 codifica un componente bien estudiado de la maquinaria de los microARN. Hemos denominado zll-2 al alelo de AGO10 que hemos identificado por ser idéntico al previamente descrito de igual denominación. Hemos clonado posicionalmente el gen TCU2, que codifica la subunidad no catalítica de NatB, una acetilasa N-terminal de proteínas. El análisis de tcu2-2, un alelo insercional de dominio público de TCU2, y de pnh-2, un alelo de AGO10 de fenotipo muy similar a zll-2, nos ha permitido concluir que el fenotipo del doble mutante tcu2-1 zll-2 es aditivo respecto a algunos rasgos, como la fusión de las primeras hojas de zll-2 y la floración temprana de tcu2-1, pero sinérgico respecto a otros, como la escasa fertilidad y la curvatura foliar. Estos rasgos superaditivos sugieren que existe una relación funcional entre los genes AGO10 y TCU2. Hemos construido transgenes TCU2pro:TCU2:GFP y TCU2pro:GUS, que nos han permitido demostrar que TCU2 es una proteína citoplásmica y que TCU2 se expresa en todos los tejidos estudiados, respectivamente. La caracterización de los alelos del gen TCU2 que hemos obtenido resultará útil para la comprensión del papel de la acetilación N-terminal de proteínas a nivel celular y del organismo en su conjunto, un proceso acerca del que se sabe muy poco tanto en los animales como en las plantas.