Caracterizacion estructural y funcional del regulador styr de la ruta de biodegradacion de estireno en pseudomonas sp y2

Zusammenfassung

El propósito principal que se ha perseguido en esta tesis es el de profundizar en el conocimiento del regulador de respuesta StyR, implicado en la biodegradación del estireno en Pseudomonas sp. Y2, con un objetivo doble: la obtención de datos que permitan en un futuro el empleo de esta cepa en procesos de Biorremediación y biotransformación del estireno, y avanzar en la comprensión del mecanismo general de actuación de los sistemas de dos componentes, muchos de los cuales están implicados en procesos patógenos en otros microorganismos. Hemos elaborado dos modelos estructurales teóricos de StyR, uno en ausencia de DNA y otro en presencia de éste, basándonos en otros reguladores de respuesta de estructura conocida. Para comprobar la validez del modelo estructural del monómero que habíamos elaborado para StyR realizamos una serie de experimentos incluyendo determinación de la estructura secundaria por dicroísmo circular, proteolisis limitada con trombina, determinación de puentes disulfuro y expresión y determinación de la estructura secundaria del dominio N-terminal aislado. Continuando con la caracterización estructural hemos obtenido información acerca de la estabilidad térmica, química y termodinámica de la proteína utilizando fundamentalmente técnicas espectroscópicas: dicroísmo circular y fluorescencia. En el apartado de caracterización funcional se han analizado las distintas funciones de la proteína, tales como fosforilación, dimerización, unión al DNA y activación de la transcripción, empleando tanto técnicas bioquímicas como genéticas. Asimismo, mediante el análisis de mutantes, hemos identificado cada una de las regiones implicadas en las distintas funciones/interacciones en StyR. Los resultados obtenidos nos han permitido elaborar una hipótesis sobre su mecanismo funcional. En base al mecanismo propuesto, la proteína StyR en solución presentaría dos dominios (N-terminal o receptor del grupo fosfato y C-terminal o de unión a DNA) unidos por un conector. En ausencia de fosforilación existiría un ión Mg2+ coordinado al Asp-12, Asp-55, Arg-57 y al Asp-11 a través de una molécula de agua. El Asp-55 es el residuo que acepta el grupo fosfato y seria estabilizado por la Lys-105. Para completar la estabilización del grupo fosforilo, la cadena lateral de la Thr-83 se aproximaría al sitio de fosforilación formando un enlace de hidrógeno. Para mantener a la Thr-83 en esta conformación, la Phe-102 adoptaría una orientación mas interna ocupando el hueco dejado por la treonina. El reconocimiento del DNA por los dominios c-terminales provocaría, simultáneamente, el acercamiento de los dominios N-terminales, que dimerizarían empleando la interfase 4/?5 estabilizando el complejo formado con el DNA. Para la formación de los dímeros sería imprescindible la flexibilización del conector, que podría tener lugar tras el primer contacto de los dominios efectores con el DNA. Por último, a consecuencia de la fosforilación existiría una repulsión del grupo fosforilo con el Asp-11 y Asp-12 que se deplazarían hacia el Asp-35, que a su vez, y debido también a repulsiones electrostáticas así como estéricas, rotaría alejándose de los dos residuos ácidos y desplazando a la Phe-34, afectando a la región ?2- 2. Este residuo de fenilalanina, parcialmente expuesto, pasaría de una localización interna a una más externa con una disposición óptima para la interacción con algún factor aún por determinar pero esencial para la activación transcripcional. Únicamente el dímero fosforilado sería capaz de activar la transcripción de los genes responsables de la degradación de estireno. Finalmente, hemos realizado un estudio comparativo de nuestra proteína con StyR de Pseudomonas fluorescens ST. Nuestros datos experimentales demuestran que los mecanismos funcionales de ambas proteínas presentan diferencias muy significativas, a pesar de que la similitud entre ellas es superior al 90%.