Optimización del metabolismo de polihidroxialcanoatos de pseudomonas putida kt2440 mediante abordajes de biología sintética y de sistemas//synthetic and systems biology approaches towards the optimization of polydroxyalkanoates metabolism in pseudomonas putida kt2440

Resumen

Pseudomonas putida KT2440 es una bacteria modelo en biotecnología que suscita mucho interés como catalizador celular, y que es susceptible de ser optimizado mediante herramientas de biología sintética y de sistemas. Su metabolismo se ha caracterizado ampliamente y se cuenta con un modelo metabólico (iJN1411), que permite la evaluación de sus capacidades metabólicas mediante una aproximación de biología de sistemas. Entre las aplicaciones biotecnológicas, KT2440 se ha usado ampliamente para la producción de PHA. Estos poliésteres presentan propiedades interesantes para reemplazar a los plásticos de origen petroquímico y se acumulan en el citoplasma bacteriano como fuente de reserva de carbono y energía. El metabolismo de PHA en P. putida está mediado por la PHA sintasa (PhaC) y la PHA despolimerasa (PhaZ), que sintetiza y degrada el PHA, respectivamente, en un ciclo continuo.En el primer capítulo se describe en profundidad la evaluación del carácter amortiguador del ciclo de PHA, validándose su capacidad de conferir robustez metabólica a P. putida. Con el fin de evaluar el efecto del bloqueo del ciclo continuo de PHA en la fisiología bacteriana, se ha delecionando el gen phaZ. Se ha validado una librería de cepas derivadas de la mutante nula phaZ con diferentes niveles de expresión del gen phaZ. Para investigar el impacto de la variación en la producción de PhaZ en el metabolismo bacteriano, se han determinado en cada cepa diferentes parámetros fisiológicos en condiciones de producción de PHA. Estos resultados sugieren un cambio del flujo de carbono cuando se interrumpe el ciclo de PHA. Para relacionar estos resultados con el metabolismo general del carbono, estos datos experimentales se han contextualizado in silico en el modelo metabólico iJN1411.En el segundo capítulo, se estudia cómo la redundancia funcional puede ser un mecanismo de robustez en cuanto a los roles fisiológicos de las isoenzimas de la isocitrato deshidrogenasa procariota (PIDH). La PIDH es una enzima ancestral y muy diversa en cuanto a su origen y estructura primaria. Sin embargo, no está claro cuál es la relevancia de la existencia de dos PIDH en las bacterias de género Pseudomonas, ya que esto es una característica observada principalmente en psicrófilos. En este capítulo, se presentan los resultados de la purificación y caracterización enzimática de las dos PIDH de P. putida. Los aminoácidos clave para la actividad catalítica en la Idh monomérica se verifican mediante mutagénesis dirigida. Para estudiar el impacto de la presencia de dos PIDH, se han evaluado los niveles de expresión de ambos genes mediante experimentos de qRT-PCR en diferentes condiciones de crecimiento. Finalmente, para estudiar el papel de las PIDH en la fisiología y metabolismo de P. putida, se diseñaron diferentes mutantes de deleción de la PIDH. Los resultados indican que sólo se puede obtener el mutante de deleción de la icd dimérica, lo que sugiere que la idh podría ser un gen esencial en P. putida. El tercer capítulo profundiza en la creación de factorías celulares para producir PHA a partir de sustratos complejos, cómo el tereftalato de polietileno (PET) y el poliuretano (PU). Se presenta un conjunto de cepas de P. putida super-productoras de PHA capaces de utilizar in silico hidrolizados PET y PU como fuentes de carbono. El modelo iJN1411, se utilizó como plataforma computacional para lograr la producción de PHA acoplada al crecimiento. Estos diseños in silico fueron implementados, evaluados mediante experimentos fisiológicos y optimizados in vivo. Para ello se delecionaron un gran número de genes necesarios e introdujeron otros, para eliminar sistemáticamente todas las vías potencialmente competidoras con el diseño in silico, y redirigir el flujo de carbono hacia la biosíntesis de PHA. Finalmente, se discute el posible impacto de las herramientas de biología sintética y de sistemas en la producción industrial de PHA a partir de sustratos sostenibles como azúcares y glicerol.