Técnicas de proteómica para la identificación de nuevos biomarcadores en enfermedades crónicasLa enfermedad de alzheimer y la alergia al polen de olivo como modelos. Proteomics techniques for the identification of new biomarkers in chronic disease: alzheimer's disease and allergy to olive pollen as models

Resumen

Se define como biomarcador a toda aquella característica que pueda servir como indicador de un proceso biológico, patológico o de una respuesta farmacológica tras una intervención terapéutica. Los biomarcadores son muy diversos, e incluyen moléculas específicas como las proteínas. La proteómica consiste en la caracterización a gran escala de todas las proteínas de una célula, tejido u organismo vivo bajo una condición determinada, mediante técnicas como la espectrometría de masas y los microarrays de proteínas. En los últimos años, estas técnicas de alto rendimiento han demostrado ser válidas para el descubrimiento de múltiples biomarcadores proteicos debido a su gran sensibilidad. La enfermedad de Alzheimer (EA) es una patología neurodegenerativa crónica que afecta a áreas fundamentales para la memoria y la percepción. Se trata de la forma de demencia más común, con una prevalencia mundial estimada de entre el 10% y el 30% en la población de edad avanzada y que se duplicará en los próximos años. Por otro lado, se estima que hoy en día hasta el 25% de la población de los países desarrollados sufre algún tipo de alergia respiratoria como la rinoconjuntivitis o el asma, que implican la producción de anticuerpos de tipo inmunoglobulina E (IgE) contra moléculas ambientales generalmente inocuas y conocidas como aeroalérgenos. En este contexto, el objetivo general de esta tesis ha sido la identificación de nuevos biomarcadores para el diagnóstico de estas dos patologías crónicas utilizando técnicas proteómicas. En un primer bloque, se procedió a la identificación de biomarcadores para el diagnóstico de la EA. Primero, se realizó la identificación de proteínas alteradas en la corteza prefrontal de pacientes con EA mediante el análisis de la expresión de 706 moléculas implicadas principalmente en procesos de señalización y comunicación celular utilizando microarrays de anticuerpos. Se encontró que un total de 40 proteínas estaban alteradas en los grupos de la EA con respecto a los grupos control, de las cuales se consiguieron validar 11 mediante otras técnicas como Western blot e inmunohistoquímica de microarrays de tejido. Después, se caracterizó la respuesta humoral de pacientes con EA para la identificación de proteínas dianas de autoanticuerpos con valor diagnóstico. Para ello, se utilizaron diferentes abordajes proteómicos, como la combinación de la tecnología phage display y microarrays de proteínas, el uso de microarrays de tipo PrEST en formato plano y en suspensión, y la inmunoprecipitación acoplada a espectrometría de masas. Péptidos con alta identidad de secuencia con cinco proteínas humanas mostraron validez para discriminar entre pacientes con la EA y controles. En el segundo bloque, se realizó un análisis proteómico completo del polen del olivo cultivado a partir de un análisis por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. Se hallaron un total de 203 proteínas distribuidas en 47 familias de alérgenos. De entre todas ellas, 20 no estaban previamente descritas en el polen del olivo. Un total de cuatro potenciales alérgenos se seleccionaron para validar su alergenicidad. Los resultados mostraron que la ciclofilina del polen de olivo era un nuevo alérgeno capaz de unir IgEs de pacientes, y se le dio el nombre de Ole e 15 de acuerdo a la nomenclatura oficial. Finalmente, se procedió a la identificación de las regiones principales de la superficie de Ole e 15 que contribuyen a la unión de IgEs, mediante el diseño de ocho quimeras por sustitución de regiones de Ole e 15 por regiones específicas de su homólogo en humanos, PPIA. Los epítopos IgE estaban distribuidos por toda la superficie de la molécula, y se identificaron dos regiones principales con epítopos conformacionales. En definitiva, en esta tesis doctoral se ha demostrado la validez del uso de diferentes técnicas proteómicas para la identificación de nuevos biomarcadores proteicos en áreas de investigación como la EA o las enfermedades respiratorias.