Estudio funcional de las beta glucosidasas del hongo talaromyces amestolkiaeAplicaciones biotecnológicas y diseño racional de catalizadores

Resumen

Introducción: La biomasa vegetal representa una importante fuente renovable de materia prima, ya que sus paredes celulares constituyen la mayor parte del carbono fijado por fotosíntesis. Estas paredes celulares están compuestas principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina. La degradación de esta última es clave para utilizar los polisacáridos de la pared celular vegetal, pero también es clave encontrar complejos enzimáticos eficaces para la hidrólisis completa de la celulosa y hemicelulosa, y así poder utilizar todos los carbohidratos que éstas contienen. Existen tres tipos de celulasas, que actúan de forma coordinada para degradar la celulosa: endoglucanasas, celobiohidrolasas y ß-glucosidasas. Aunque todas son necesarias en los cócteles enzimáticos, los mayores esfuerzos se centran en descubrir nuevas ß-glucosidasas, ya que representan el paso clave para la sacarificación de la celulosa. Objetivos: El objetivo del trabajo fue profundizar en el conocimiento de las tres principales ß-glucosidasas producidas por el hongo T. amestolkiae, enzimas robustas que poseen un papel esencial en la transformación de la celulosa. Resultados: Estudio del genoma y proteoma del hongo T. amestolkiae: El hongo Talaromyces amestolkiae demostró ser un excelente productor de celulasas, secretando altos niveles de ß-glucosidasas, ß-1,4-endoglucanasas, y celobiohidrolasas. La secuenciación y el análisis del genoma de este hongo revelaron la existencia de múltiples genes que codifican ß-glucosidasas. Caracterización de BGL-2, la primera ß-1,4-glucosidasa con un dominio de unión a celulosa: La BGL-2 es la principal ß-glucosidasa secretada por este hongo T. amestolkiae, en presencia de inductores celulósicos. Es una glicosil hidrolasa de la familia GH3 y posee un (dominio de unión a celulosa), una característica inusual en este tipo de proteínas. Caracterización de BGL-3, una ß-glucosidasa versátil e inducible cuando se agota la fuente de carbono: La síntesis de la ß-glucosidasa BGL3 en el hongo T. amestolkiae se produce bajo estímulos de agotamiento de carbono. La enzima mostró una alta estabilidad térmica y eficiencia sobre sustratos como pNPG, celobiosa y otros celooligosacáridos. Caracterización de BGL-1, una ß-glucosidasa glucotolerante: La ßglucosidasa BGL-1 del hongo T. amestolkiae destaca por su glucotolerancia, presentando un Ki de 3.87 mM, uno de los más altos detectados hasta la fecha. Síntesis de glicósidos de interés usando las ß-glucosidasa de T. amestolkiae: La transglicosilación enzimática es una de las técnicas más prometedoras para obtener nuevos glicoconjugados. Diferentes experimentos de transglicosilación se llevaron a cabo utilizando las ßglucosidasas BGL-2 y BGL-3 del hongo T. amestolkiae. Después de un primer análisis, se identificaron derivados mono-glucosilados de hidroxitirosol, alcohol vainillínico. Tras obtener sus respectivos glucósidos y purificarlos, se evaluó su efecto biológico usando modelos de células de cáncer de mama. Ambos compuestos mostraron un incremento de la capacidad antiproliferativa, respecto a los compuestos no glicosilados. Mediante ingeniería de proteínas, se convirtió la BGL-1 en una glicosintasa. BGL-1-E521G, que fue capaz de utilizar glucosa fluorada como donador en reacciones de transglicosilación, en las que se sintetizaron de manera regioselectiva nuevos derivados glicosilados. Conclusiones: El trabajo realizado en la presente tesis doctoral demuestra que el genoma del hongo T. amestolkiae contiene varios genes que codifican ß-glucosidasas y secreta altos niveles de esta actividad, independientemente de la disponibilidad de la fuente de carbono. Se han purificado y caracterizado tres nuevas ß-glucosidasas que pueden ser aplicadas en procesos de sacarificación de residuos lignocelulósicos, y en la obtención de otros productos de valor añadido.