Engineering of fungal laccase as biocatalyst for organic synthesis

Resumen

Las lacasas son enzimas oxidasas multicobre capaces de oxidar una gran variedad de compuestos. Una de las aplicaciones más interesantes de las lacasas es la síntesis de compuestos orgánicos de alto valor añadido, ofreciendo una mayor selectividad que las reacciones químicas y con menor generación de residuos tóxicos. Muchas de estas reacciones requieren del empleo de lacasas fúngicas de alto potencial redox debido a su mayor poder oxidativo. Tal es el caso de la síntesis de polianilina (PANI), un polímero electroconductor con una amplia variedad de aplicaciones. Las condiciones de reacción (pH ácido y presencia de surfactantes) y el alto potencial redox de la anilina a pH ácido dificultan la acción de la enzima, haciendo necesaria su ingeniería para optimizar su actividad y estabilidad en dichas condiciones. El principal objetivo de esta Tesis Doctoral fue obtener una lacasa fúngica de alto potencial redox que actuase como biocatalizador para reacciones de síntesis orgánica, con especial interés en la síntesis de PANI electroconductivo. Para ello se llevaron a cabo diferentes tareas: i) Optimización de las condiciones de reacción para la síntesis de PANI: Se seleccionó una variante de lacasa previamente obtenida en el laboratorio (7D5) como punto de partida para su ingeniería hacia síntesis de PANI debido a su mayor actividad sobre aminas aromáticas y mayor estabilidad a pH ácido. Esta lacasa se utilizó para poner a punto las condiciones de síntesis de PANI. Tras una exhaustiva caracterización de los polímeros resultantes, se determinaron las condiciones óptimas de síntesis de sal de esmeraldina obteniéndose, con un notable rendimiento, un PANI soluble en agua, que presenta una estructura supramolecular en forma de nanofibras y una excelente electroactividad y electroconductividad. ii) Mejora de la actividad de la lacasa frente a los sustratos de interés y de su estabilidad a las condiciones de reacción, caracterización de las nuevas variantes obtenidas: Mediante evolución dirigida y diseño racional apoyado por computación se identificaron una serie de mutaciones que incrementaron la estabilidad de la enzima a pH extremo y alta temperatura mejorando al mismo tiempo la actividad de la enzima frente a diferentes sustratos. Estas mejoras se asociaron a dos mutaciones en la entrada al bolsillo catalítico identificadas mediante simulación computacional y a cuatro mutaciones en la región del C-terminal que incrementaron su flexibilidad. iii) Mejora de la secreción de la enzima por Saccharomyces cerevisiae y expresión de las nuevas variantes de lacasa en una cepa industrial de Aspergillus oryzae: Mediante evolución dirigida de la secuencia completa del gen asociada a su péptido señal se obtuvieron dos mutaciones en dicho péptido que junto con una mutación en el gen de la lacasa incrementaron su secreción a niveles superiores a los descritos hasta la fecha en S. cerevisiae. Además, la lacasa 7D5, junto con varias de sus variantes evolucionadas, fueron híper-expresadas en una cepa industrial de A. oryzae. Esto permitió obtener la estructura cristalina de 7D5 (PDB: 6H5Y) y realizar un estudio estructura-función comparado con la lacasa salvaje del basidiomiceto con la que comparte un 98 % de identidad de secuencia. Mediante técnicas computacionales se determinó que la mejor actividad catalítica de 7D5 se debía a una mutación en el bolsillo catalítico que mejoraba el posicionamiento y transferencia electrónica de los sustratos al cobre catalítico. La menor estabilidad de la lacasa 7D5 comparado con lacasa salvaje se relacionó, mediante estudios computacionales, con la pérdida de flexibilidad en algunos lazos superficiales de la proteína provocada por las mutaciones adquiridas. Una de las variantes evolucionadas en S. cerevisiae e hiper-expresada en A. oryzae se aplicó con éxito como biocatalizador de la síntesis de PANI y de otro compuesto orgánico cuya caracterización como colorantes textiles se llevó a cabo en un entorno industrial.