Integración de técnicas basadas en ADN para el desarrollo de biosensores aplicados en seguridad alimentaria

Resumen

La seguridad alimentaria está garantizada cuando se dispone de alimentos suficientes, seguros y nutritivos. Esta garantía, además, ha de cumplirse a lo largo de todo el proceso productivo, lo que se conoce como ¿seguridad de la granja a la mesa¿, surgiendo así una nueva forma de abordar el problema con un enfoque global y un tratamiento integral del consumo de alimentos (1). Los métodos clásicos empleados en seguridad alimentaria requieren laboriosas etapas de preparación y purificación de muestras, lo que unido a su baja capacidad de trabajo y elevado coste, hace que sean poco adecuadas para llevar a cabo en ensayos rutinarios en puntos de control. Las técnicas moleculares basadas en el empleo de anticuerpos y/o ácidos nucleicos, son actualmente ampliamente utilizadas en el análisis de ciertas amenazas alimentarias, como por ejemplo, la detección de alérgenos, microorganismos, organismos genéticamente modificados (OGM), o la autentificación de determinadas especies (2). Los métodos genéticos han demostrado ser una herramienta muy valiosa en este campo. Dos de las propuestas más sólidas para la detección de ADN son los ensayos de hibridación en formato micromatriz (3) y la PCR a tiempo real (rt-PCR) (4). Sin embargo, estas técnicas aun son susceptibles de mejora, ya que son caras, complejasy requieren personal y equipamiento especializado, lo que hace que solo se utilicen en laboratorios bien dotados y en investigación. Como alternativa a estas limitaciones, destaca la tecnología de los biosensores, la cual proporciona la misma fiabilidad en resultados pero de manera más sencilla y rápida, y con mayores posibilidades de portabilidad y automatización (5). A pesar de que la PCR se considera el método de referencia para la amplificación de ácidos nucleicos, presenta una serie de limitaciones que dificultan su integración en biosensores integrados. Requiere un estricto control de la temperatura, lo que dificulta el diseño de los dispositivos y conlleva un gasto energético elevado. Además, debido a la alta temperatura necesaria para la etapa de desnaturalización (95 ºC), los materiales a emplear están limitados y pueden producirse fenómenos de evaporación de agua y formación de burbujas indeseables. Por tanto, en la presente tesis se estudiaron diversas técnicas de amplificación isoterma, que permiten copiar el ADN a temperatura constante, siendo más compatibles con el desarrollo de sistemas de análisis integrado y/o automatizado (6). Por otro lado, la demanda de métodos de detección sencillos y específicos, ha llevado a la integración de la PCR con tecnologías de cuantificación asequibles. Entre éstas, destaca la tecnología de los discos compactos, que emplea discos convencionales (CDs, DVDs, Blu-Ray) como plataforma bionalítica de hibridación y un lector de DVDs comercial como detector óptico. Los discos compactos han demostrado múltiples ventajas: elevada resistencia, buenas propiedades ópticas, gran superficie de análisis y bajo coste (7). Así pues, esta tesis se ha centrado en el desarrollo de un biosensor basado en la tecnología de disco compacto para la detección de ácidos nucleicos en aplicaciones de seguridad alimentaria. El objetivo principal de la investigación ha sido integrar las etapas de amplificación, reconocimiento y detección en un único dispositivo, con el fin de obtener un biosensor eficaz, fácilmente automatizable, con un tiempo de respuesta rápido y adaptable a aplicaciones ¿point-of-control¿. Los estudios desarrollados han permitido la detección semicuantitativa o cuantitativa de diversas amenazas alimentarias, y se caracterizan por incorporar un cierto grado de miniaturización, integración y automatización. De este modo, una o varias etapas del proceso analítico tienen lugar sobre la superficie de un disco compacto, y la lectura de los resultados se obtiene mediante un lector de audio-video estándar. Para ello, se propusieron 4 bloques de trabajo. En una primera etapa de la investigación, se propuso vez la integración de la tecnología de disco compacto con un ensayo múltiple de amplificación e hibridación. El estudio, aplicado a la detección de tres alérgenos alimentarios (avellana Corylus avellana L., cacahuete Arachis hypogaea y soja Glycine max), se basó en la amplificación simultánea por PCR y en la detección mediante ensayos de hibridación sobre micromatrices de ADN empleando la tecnología de disco compacto como plataforma y detector. Para ello, se llevaron a cabo diferentes estudios de optimización en cuanto al método de extracción de ADN genómico, el diseño de los cebadores, la reacción de PCR múltiple y el protocolo de hibridación de los fragmentos amplificados con las sondas de ADN inmovilizadas sobre la superficie de un DVD. Los resultados obtenidos fueron satisfactorios en términos se sensibilidad (1 µg/g) y reproducibilidad (RSD 8%), siendo comparables a los obtenidos mediante otras técnicas de referencia como ELISA o rt-PCR. Este trabajo dio lugar a una publicación científica: - Tortajada-Genaro, L. A., Santiago-Felipe, S., Morais, S., Gabaldo¿n, J. A., Puchades, R., Maquieira, A. Multiplex DNA detection of food allergens on a digital versatile disk. J. Agric.Food Chem., 2012, 60, 36¿43. En la segunda etapa de investigación, se estudió la compatibilidad algunas técnicas de amplificación isoterma con la detección mediante ensayos de hibridación con sondas de ácidos nucleicos sobre diferentes plataformas. Las reacciones isotermas estudiadas fueron la amplificación por recombinasa polimerasa (RPA) (8) y la amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) (9). La RPA es un método de amplificación específico de secuencia, que funciona entre 37 y 42 ºC, y emplea proteínas de unión para separar la doble hélice y unir los cebadores a las hebras simples. La MDA es un método de amplificación masivo que no requiere diseño específico de cebadores ya que la Phi29 polimerasa combinada con un hexámero aleatorio amplifica al azar todo el genoma a una temperatura constante de 30 ºC. Los resultados obtenidos en esta segunda etapa se agrupan en dos bloques: En primer lugar, se propuso la amplificación por RPA combinada con la detección mediante ensayos de hibridación en placa ELISA (RPA-ELISA) (10). El estudio, se centró en el análisis de diferentes amenazas alimentarias, detectándose alérgenos (avellana, cacahuete, soja, tomate y maíz), organismos modificados genéticamente (p35S, tNOS), bacterias patógenas (Salmonella spp., Cronobacter spp. y Campylobacter spp.)y hongos (Fusarium spp.). Para ello, se pusieron a punto de las reacciones de amplificación por RPA para cada analito y se optimizaron tanto la hibridación de los fragmentos amplificados con las sondas de ADN inmovilizadas en la placa ELISA, como los ensayos de revelado y detección. Además, los resultados obtenidos se compararon con los obtenidos mediante amplificación por PCR. Los resultados obtenidos fueron satisfactorios en términos se sensibilidad (1¿20 µg/g para ingredientes y 10¿100 CFU/mL para patógenos) y reproducibilidad (RSD 6-12%), y se demostró que la integración de la amplificación isoterma con la detección mediante ensayos de hibridación en placa ELISA es posible y con resultados comparables a los obtenidos mediante la PCR convencional. En segundo lugar, se propuso la combinación de las tecnologías isotermas de amplificación, RPA y MDA, con la posterior detección mediante ensayos de hibridación sobre la superficie de un disco compacto. El trabajo se aplicó a la detección dúplex de las bacterias patógenas Salmonella spp. y Cronobacter spp., y constó de una fase de optimización de las reacciones de amplificación, la evaluación de diferentes protocolos post-amplificación para los fragmentos amplificados por MDA, la optimización de los ensayos de hibridación con las sondas de ADN inmovilizadas sobre la superficie de un DVD y del estudio del efecto de posibles inhibidores presentes en la matriz alimentaria sobre las diferentes polimerasas. Por último, se realizó un estudió comparativo entre los resultados obtenidos para cada técnica de amplificación. Los resultados obtenidos fueron satisfactorios, alcanzándose un límite de detección de 10-100 CFU/mL y una variación menor del 12%. Por tanto, se demostró que la integración de la amplificación isoterma con la detección mediante ensayos de hibridación empleando la tecnología del disco compacto es posible y con resultados comparables a los obtenidos mediante la PCR convencional. Así pues, esta metodología ofrece ventajas por su rapidez, sensibilidad, especificidad y bajo coste, lo que convierte a las alternativas de amplificación isoterma en una buena opción a tener en cuenta en el desarrollo de biosensores para ADN. Como resultado de esta fase de investigación se obtuvieron diversas publicaciones científicas: - Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. A., Puchades, R., Maquieira, A. ¿Recombinase polymerase and enzymelinked immunosorbent assay as a DNA amplificationdetection strategy for food análisis¿, Anal. Chim. Acta, 2014, 811, 81¿ 87. - Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. A., Morais, S., Puchades, R., Maquieira, A. ¿Isothermal DNA amplification strategies for duplex microorganism detection¿, Food Chem., 2015, 174, 509¿515. En la tercera aproximación de esta tesis, se propuso la integración de las fases de amplificación e hibridación en una única etapa, simplificando enormemente el proceso analítico. Para ello, se estudió la realización de la amplificación en fase sólida. En este formato, un cebador se ancla sobre un soporte sólido, mientras que los otros componentes de la reacción permanecen en la fase líquida, de este modo, la elongación enzimática del cebador da lugar a un producto de amplificación anclado en la superficie, que es revelado y detectado (11) Así pues, se realizó la amplificación isoterma por RPA en fase sólida sobre la superficie del disco mediante diferentes formatos: gota, cámaras microfluídicas adheridas a la superficie del disco o microreactores integrados en el sustrato del disco. En los dos primeros formatos, las reacciones tuvieron lugar en la superficie del DVD y la medición se realizó por reflexión láser del lector, mientras que el tercer caso la lectura se realizó mediante transmisión. El trabajo se aplicó a la detección de diferentes amenazas alimentarias (bacterias patógenas y OGMs). Los resultados fueron satisfactorios para los tres formatos, alcanzándose un límite de detección inferior a 50 µg/g para OGMs y 30 CFU/mL para patógenos; y una variación inferior al 20%. Además, la reacción tuvo lugar a temperatura constante (37 ºC) y tiempos cortos (40 min), siendo 5 veces más rápida que los métodos de amplificación convencionales (PCR). Estas aproximaciones proponen por primera el empleo de la tecnología de disco compacto tanto para la realización de la amplificación en fase sólida como para la utilización de dispositivos microfluídicos o microreactores, y presentan importantes ventajas tales como alta capacidad de trabajo, miniaturización (25 µL, 6 µL y 3 µL, para el formato gota, cámara microfluídica y pocillo, respectivamente), portabilidad y sencillez de operación, con un coste muy competitivo. Como resultado de esta fase de investigación se obtuvieron diversas publicaciones científicas: - Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. A., Morais, S., Puchades, R., Maquieira, A. ¿One-pot isothermal DNA amplification- hybridisation and detection by a disc-based method¿, Sens. Actuators B, 2014, 197, 385¿404. - Tortajada-Genaro, L. A., Santiago-Felipe, S., Amasia, M., Russom, A., Maquieira, A. ¿Isothermal solid-phase recombinase polymerase amplification on microfluidic digital versatile discs (DVDs)¿, RSC Adv., 2015, 5, 29987-29995. - Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. A., Puchades, R., Maquieira, A., ¿Parallel solid-phase isothermal amplification and detection by optical disc technology¿, Anal. Chem, 2015, Submitted. Finalmente, en la última etapa, se propuso desarrollar una metodología para monitorizar a tiempo real la síntesis de ADN, integrando así las etapas de amplificación y cuantificación. Para ello, se empleó la reacción de amplificación isoterma mediada por bucle (LAMP), que es llevada a cabo por la enzima Bst polimerasa. Una de las mayores ventajas de la LAMP es su capacidad para sintetizar grandes cantidades de ADN en cortos períodos de tiempo. Como resultado, se producen elevadas concentraciones de iones pirofosfato que, con el magnesio del medio de reacción, generan un precipitado blanco facilitando la detección visual. Además, existe una elevada correlación entre la turbidez producida y la cantidad de ADN de partida, lo cual permite un análisis cuantitativo de las muestras (12). Para el desarrollo del método propuesto, las reacciones tuvieron lugar en micropocillos integrados en la estructura del DVD (3µL de reacción) y la lectura se realizó por transmisión mediante el escaneo cíclico de los pocillos. De este modo, se obtuvieron registros de las cinéticas de amplificación que se relacionaron con el número de copias de cada gen diana, permitiendo así su cuantificación. El trabajo se aplicó a la detección de la bacteria patógena Salmonella spp. y a detección de carne de bovino. Constó de una fase de optimización de las reacciones de amplificación y de estudio de diferentes formatos de detección de los productos amplificados. Se obtuvieron buenos niveles de reproducibilidad (RSD<20%) y sensibilidad, llegando a 5 CFU/mL en el caso de patógenos y 10 µg/g para la detección de carne de ternera. Como resultado de esta fase de investigación se ha obtenido una publicaciones científica y un desarrollo de patente aún en revisión: - Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. A., Carrrascosa, J., Puchades, R., Maquieira, A., ¿Micro-reactors on compact discs for real-time loop-mediated isothermal amplification¿, Analyst, 2015, Submitted. - Maquieira, A., Tortajada-Genaro, L. A., Santiago-Felipe, S., Morais, S., ¿Dispositivo integrado para el seguimiento de reacciones basado en microreactores en disco óptico¿. Presentado el 20-03-2015. En fase de evaluación por la OEPM (P201530371). A pesar de la simplicidad de los métodos desarrollados, se ha demostrado que la integración de las técnicas de amplificación isoterma con la detección mediante la tecnología del disco compacto es altamente competitiva, alcanzándose resultados satisfactorios y comparables a los obtenidos mediante técnicas como PCR cuantitativa. Así pues, los biosensores propuestos resultan idóneos para aplicaciones rutinarias en puntos de control a lo largo de toda la cadena de producción-distribución alimentaria, abriendo, además, nuevas puertas a otro tipo de aplicaciones. Referencias bibliográficas: 1. Libro Blanco sobre Seguridad Alimentaria. 2000, Comisión de las comunidades europeas, Bruselas. 2. AESA (Agencia Española de Seguridad Alimentaria) Y Genoma España. 2005, ISBN: 84-609-5044-1. 3. Ng, J. Chong, S. ISBN: 978-953-307-443-6, InTech, 2001, DOI: 10.5772/17187. 4. Pierik, A., Boamfa, M., van Zelst, M., Clout, D., Stapert, H., Dijksman, F., Broer, D., Wimberger-Friedl, R. Lab Chip, 2012, 12, 1897-1902. 5. Thévenot, D. R., Toth, K., Durst, R. A., Wilson, G. S. Biosens. Bioelectron., 2001, 16, 121. 6. Craw, P., Balachandran, W. Lab Chip, 2012, 12, 2469. 7. Maquieira, A. Compact discs technology for clinical analysis of drugs. Biosensors and Molecular Technologies for Cancer Diagnostics, 2012, 417. 8. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. PLOS Biol., 2006, 4, 1115. 9. Dean, F. B., Hosono, S., Fang, L. H., Wu, X. H., Faruqi, A. F., Bray-Ward, P., Sun, Z. Y., Zong, Q. L., Du, Y. F., Du, J., Driscoll, M., Song, W. M., Kingsmore, S. F., Egholm, M., Lasken, R.S. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99, 5261. 10. Musiani, M., Venturoli, S., Gallinella, G., Zerbini, M. Nat Protoc., 2007, 2, 2502. 11. Adessi, C., Matton, G., Ayala, G., Turcatti, G., Mermod, J.J., Mayer, P., Kawashima, E. Nucleic Acids Res. 2000, 28, e87. 12. Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., Hase, T. Nucleic Acids Res., 2000, 12, e63.