Estudio del papel de las amebas de vida libre como reservorio de helicobacter pylori y otras bacterias patógenas en aguas y alimentos mediante técnicas moleculares

Resumen

En esta Tesis se estudia el posible papel de las FLA como reservorio de H. pylori y otras bacterias patógenas en aguas y alimentos mediante técnicas moleculares. En primer lugar se realizó un ensayo de cocultivo entre la bacteria H. pylori y la ameba Acanthamoeba castellanii. Se comprobó, mediante técnicas moleculares específicas para la detección de células viables, PMA-qPCR y DVC-FISH, que la ameba es capaz de internalizar a la bacteria y que esta última permanece viable, demostrando que H. pylori se comporta como una bacteria ARB. Seguidamente, se analizaron un total de 120 muestras ambientales, 100 de agua y 20 de vegetales para comprobar la presencia, tanto de FLA como de H. pylori internalizado en estas FLA. En el caso de las muestras de agua, se analizaron 69 muestras de agua residual y 31 de agua potable. Un total de 55 (79,7%) muestras de agua residual y 12 (38,7%) de agua potable resultaron positivas para la presencia de FLA. Mediante la técnica PMA-qPCR se demostró la presencia de H. pylori internalizado en las FLA presentes en 28 (50,9%) y 11 (91,7%) de las muestras de agua residual y potable analizadas, respectivamente. Mediante DVC-FISH se demostró que las células de H. pylori internalizadas dentro de las FLA presentes en las muestras eran viables en 16 (29,5%) y 5 (41,7%) de las muestras de agua residual y potable analizadas, respectivamente. Además, se consiguió recuperar formas viables cultivables de H. pylori procedente del interior de FLA en 10 (18,2%) de las muestras de agua residual analizadas. Las FLA aisladas e identificadas en las aguas residuales pertenecieron a los géneros Acanthamoeba, Naegleria, Vanellidae y a la familia Vahlkampfiidae. En el caso del agua potable, las FLA aisladas e identificadas pertenecieron a los géneros Acanthamoeba, Echinamoeba y Vermamoeba. En el caso de las muestras de vegetales, concretamente lechugas, todas ellas resultaron positivas para el aislamiento de FLA (100%). Mediante la técnica PMA-qPCR se demostró la presencia de H. pylori internalizado en las FLA en 11 (55,0%) de las muestras y, mediante DVC-FISH, se demostró que las células de H. pylori internalizadas dentro de las FLA eran viables en 5 (25,0%) de las muestras. En este caso no se recuperaron formas viables cultivables de la bacteria. Finalmente, mediante metagenómica de secuenciación dirigida, se analizó el microbioma de las FLA presentes en 20 de las muestras analizadas en esta Tesis (11 de agua residual, 3 de agua potable y 6 de lechugas). Para ello, se eligieron los iniciadores, se evaluaron in silico e in vitro y, una vez comprobada su idoneidad, se emplearon para la secuenciación de las muestras. En los tres tipos de muestras, la clase bacteriana más abundante fue la Gammaproteobacteria. Para los tres tipos de muestras, los filos más abundantes de las bacterias del microbioma de las FLA fueron Proteobacteria y Bacteroidetes y, en el caso del agua residual, también lo fue el filo Planctomycetes. H. pylori se detectó mediante esta técnica en los tres tipos de muestra. Además, como parte del microbioma de FLA de muestras ambientales, se detectaron otras bacterias de interés para la salud pública, tales como Aeromonas, Legionella, Mycobaterium o Pseudomonas. Los resultados obtenidos en esta Tesis demuestran la presencia de FLA patógenas en las muestras ambientales, así como el hecho de que, en algunos casos, estas son transportadoras de bacterias patógenas. Este trabajo también confirma que H. pylori se comporta como una bacteria ARB y que se encuentra viable en el interior de FLA presentes, tanto en aguas residuales y potables como en vegetales. De esta forma, se postula que un modo de transmisión de esta bacteria podría ser a través de las FLA presentes en agua o vegetales.