Identificación de las proteínas fosfatasas de especificidad dual dianas de los receptores de nucleótidos en los astrocitos cerebelosos

Resumen

En las últimas décadas nuestro grupo se ha centrado en el estudio de la señalización mediada por nucleótidos en el cerebelo, identificando algunas cascadas de señalización intracelular activadas por receptores de nucleótidos ionotrópicos P2X7 y metabotrópicos P2Y13 y P2Y2/P2Y4, y su papel neuroprotector en las neuronas granulares y en los astrocitos cerebelosos. En las neuronas granulares los estímulos genotóxicos provocan la muerte celular por una sobreactivación de varias MAP quinasas, como p38 y ERK1/2, como consecuencia de una disminución en la expresión de las proteínas fosfatasas de especificidad dual que desfosforilan e inactivan estas MAP quinasas. La estimulación de los receptores P2Y13 y P2X7 previene la muerte neuronal al inducir la expresión de las fosfatasas DUSP2 y DUSP6, respectivamente. En base a esto, en la presente Tesis Doctoral se decidió analizar la posible regulación de las fosfatasas DUSP6/MKP-3 y DUSP1/MKP-1 en los astrocitos cerebelosos, como modelo de células gliales. En primer lugar, hemos demostrado la capacidad de los receptores P2X7 y P2Y2/P2Y4 para regular los niveles de la fosfatasa DUSP6, siguiendo un patrón bifásico similar al observado tras la estimulación de los receptores de EGF. Dicha regulación comienza con una disminución inicial consecuencia de la degradación vía proteasoma de la fosfatasa, proceso dependiente de ERK1/2 y que conlleva la fosforilación de DUSP6 en la serina 197. Posteriormente se produce una recuperación de los niveles de la fosfatasa, consecuencia de la inducción transcripcional del gen Dusp6 dependiente de la activación de ERK1/2. Mediante el empleo del inhibidor alostérico de DUSP6 y DUSP1, BCI, comprobamos cómo la inactivación de estas fosfatasas provoca un incremento a lo largo del tiempo en los niveles de fosforilación de ERK1/2, sobre todo a nivel citoplásmico, de la MAPK nuclear p38, y la proteína fosfatasa nuclear DUSP1. Esto nos llevó a analizar la posible regulación de esta fosfatasa nuclear. La estimulación de los receptores P2X7, P2Y2/P2Y4, y de EGF produce un incremento rápido de los niveles de la fosfatasa DUSP1, disminuyendo posteriormente hasta alcanzar los niveles basales. El incremento se debe a una inducción transcripcional del gen Dusp1, proceso que es dependiente de ERK1/2, y de p38 en el caso del receptor P2X7. Hemos demostrado que la estimulación de los receptores P2X7 produce un incremento en la fosforilación de DUSP1, en las serina 323 y 359. La regulación de los niveles de las proteínas fosfatasas DUSP6 y DUSP1 por los receptores P2X7 y P2Y2/P2Y4 depende en parte de la transactivación de los receptores de EGF. El tratamiento con un inhibidor de la actividad tirosina quinasa del receptor de EGF, AG-1478, bloquea la degradación inicial de la proteína DUSP6 producida tras estimulación de los receptores P2Y2/P2Y4. De igual manera, la inducción transcripcional de Dusp6 se bloquea por el tratamiento con AG-1478, mientras que la inducción transcripcional de Dusp1 no parece verse afectada. Por último, también analizamos los efectos de agonistas nucleotídicos sobre las propiedades mecánicas de los astrocitos mediante microscopía de fuerza atómica. La estimulación de los receptores P2X7, P2Y2/P2Y4 y P2Y13 provoca un aumento en la rigidez y propiedades adhesivas de la membrana, y disminuye su elasticidad. Como conclusión, podemos decir que los receptores P2X7 y P2Y2/P2Y4 pueden regular los niveles de dos proteínas de especificidad dual fundamentales en la regulación de la actividad de las MAP quinasas, DUSP6 y DUSP1, siguiendo cinéticas distintas, de manera dependiente de la transactivación de receptores de EGF. Hemos demostrado que la microscopía de fuerza atómica también permite el estudio de los cambios que tienen lugar en una célula tras la estimulación de los receptores de nucleótidos, esenciales para desencadenar proliferación, diferenciación e incluso la muerte celular.