Molecular mechanisms underlying the role of grk2 in breast cancer

Resumen

Cancer is a highly complex process often driven by oncogenic mutations and/or altered signaling nodes, the so-called onco-modulators that cooperate with oncogene-governed pathways to strengthen tumor hallmarks. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) has recently emerged as a relevant oncomodulator by modulating G protein-coupled receptors (GPCR) and Growth Factor-Receptor Tyrosine Kinases (GF-RTKs), as well as non-receptor partners/substrates in a cell type-specific manner. In this work, we further explore the role of increased GRK2 protein levels in breast cancer (BC) growth and metastasis. Our results show that GRK2 fosters mitogenic signaling by cross-modulation of chemokine GPCRs CXCR4/ACKR3 and EGF-responding GF-RTKs (EGFR and HER2/3), often dysregulated in most types of BC. Our data shows that GRK2 enhances GFtransducing molecules Ras and Pin1 and MAPK activation in the luminal-A subtype BC cell line MCF7, leading to increased primary tumor growth in vivo. Furthermore, GRK2 reshapes the molecular profile of MCF7 or triple-negative MDA-MB-231 cells, intensifying mesenchymal features and functionality of invadopodia and actin regulators, which ultimately fosters pulmonary metastasis occurrence. We identify the actin cytoskeleton modulator Cofilin-1 (CFL1) as new target of the BC over-activated GRK2-Histone Deacetylase-6 (HDAC6) axis in which mitogenic stimuli converge. Our data indicate that MAPK-mediated phosphorylation of GRK2 and subsequent modulation of HDAC6 would have opposite effects in the acetylation status of HDAC6 substrates such as tubulin or CFL1, altogether favoring cell migration and invasion. We also show that both GRK2 and EGFR can alter CXCR4-mediated Gi1 activation in model HEK-293 cells, while more complex interactions between these receptors and modulation by GRK2 occur in BC cell lines. In luminal-A, luminal-B or triple negative BC cell models, we find an unanticipated heterogeneity in expression profiles of GRK2 and CXCR4/ACKR3, EGFR and HER2/3 receptors, subcellular distribution of CXCR4/ACKR3 receptors and ability of CXCL12 to signal to downstream receptor cascades. Of note, GRK2 mediates cooperation of CXCR4/ACKR3 and EGFRHER2 receptors towards ERK1/2 activation in Her2-enriched BC cell line MDA-MB-361, with the involvement of Gi and tyrosine kinase Lyn proteins. Moreover, we identify GRK2 as a potential target of Lyn, and the inhibition of either GRK2 or Lyn decreases CXCL12-directed migration in MD-MB-231 cells, suggesting both kinases act as a functional tandem linking CXCR4/ACKR3 and GF-RTKs in oncogenic contexts. Overall, these results confirm an integrative role of GRK2 in GF-RTK and CXCR4/ACKR3 cooperation and downstream signaling, promoting growth of BC cells and changes in the acetylome profile of cytoskeleton components and regulators for enhanced invasive motility, thus pointing out GRK2 as a new drug target for the treatment of breast cancer subtypes with different molecular signatures. El cáncer es un proceso muy complejo impulsado por mutaciones oncogénicas o alteraciones en nodos de señalización, denominados onco-moduladores, que cooperan para fortalecer las características tumorales. La quinasa de receptores acoplados a proteínas G GRK2 se perfila como un oncomodulador relevante debido a que regula receptores acoplados a proteína G (GPCR) y receptores de factores de crecimiento con actividad tirosina quinasa (GF-RTK), así como otros sustratos e interactores, de forma específica del tipo celular. En este trabajo ahondamos en cómo el aumento de GRK2 afecta al crecimiento y metástasis del cáncer de mama, mostrando que fomenta la progresión tumoral modulando las interacciones funcionales entre los receptores de quimioquinas CXCR4/ACKR3 y GF-RTKs de la familia del factor de crecimiento epidérmico EGF (EGFR y HER2/ 3), a menudo desregulados en diversos subtipos de cáncer de mama. GRK2 potencia la expresión de Ras y Pin1, proteínas transductoras de la señalización de EGF, así como la activación de vías mitogénicas en células MCF7 (subtipo Luminal-A), promoviendo mayor crecimiento tumoral in vivo. Además, GRK2 reconfigura el perfil molecular de células MCF7 o triple-negativas MDA-MB-231, potenciando las características mesenquimales e invasivas, lo que facilita la aparición de metástasis pulmonares in vivo. Identificamos al modulador del citoesqueleto de actina Cofilina-1 (CFL1) como una nueva diana del eje de señalización GRK2-Histona Deacetilasa-6 (HDAC6) híper-activado en cáncer de mama por diversos estímulos mitogénicos. La fosforilación de GRK2 por MAPK y ulterior modulación de HDAC6 tiene efectos opuestos en el estado de acetilación de diversos sustratos de HDAC6 como tubulina o CFL1, favoreciendo en su conjunto la migración e invasión celular. Tanto GRK2 como EGFR pueden alterar la activación del efector Gi1 vía CXCR4 en células modelo HEK-293, mientras que la interrelación de estos receptores y su modulación por GRK2 es más compleja en líneas celulares de cáncer de mama. En células luminal-A, luminal-B o triple negativas existe una sorprendente heterogenidad en los patrones de expresión de GRK2 y de receptores CXCR4/ACKR3, EGFR o HER2/3, en la distribución subcelular de CXCR4/ACKR3 y en la capacidad señalizadora de su ligando CXCL12. En la línea MDA-MB-361, modelo de subtipo Her2- positivo, GRK2 propicia la cooperación entre CXCR4/ACKR3 y EGFR-HER2 para activar ERK1/2 vía la proteína Gi1 y la tirosina quinasa Lyn. Hallamos que GRK2 es una potencial diana de Lyn, y la inhibición de cada quinasa disminuye la migración de células MD-MB-231 a CXCL12, sugiriendo que forman un tándem funcional conectando CXCR4/ACKR3 y GF-RTKs en contextos oncogénicos. Nuestros resultados confirman la mediación de GRK2 en la cooperación entre estos receptores, favoreciendo el crecimiento de células tumorales de mama y la invasividad celular por cambios en la acetilación de componentes y reguladores del citoesqueleto. GRK2 se postula como una posible diana para el tratamiento de distintos subtipos moleculares de cáncer de mama.