New insights into the crosstalk between the tgf-β and the egf receptor pathways during liver regeneration and hepatocarcinogenesis

Resumen

El factor de crecimiento transformante-beta (TGF-β) es un importante supresor del crecimiento en hepatocitos, inhibiendo proliferación e induciendo muerte celular. No obstante, también desempeña otras funciones i tales como procesos de transición epitelio-mesénquima (EMT), que pueden contribuir a la invasión y progresión tumoral. El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) pertenece a la familia de los receptores tirosina quinasa, y está implicado en la proliferación y supervivencia celular, así como en diferenciación y adhesión. Con el objetivo de estudiar la conexión entre ambas vías, en nuestro grupo se han generado diferentes modelos animales y celulares. El modelo in vivo se basa en ratones transgénicos que expresan específicamente en los hepatocitos una forma truncada (en el dominio quinasa) del EGFR humano, actuando como dominante negativo, disminuyendo la señalización de la vía. Por otro lado, se han generado modelos in vitro, en los que la expresión del EGFR ha sido disminuida mediante shRNA en diferentes líneas de carcinoma hepatocelular (HCC). Esta tesis se enfocó, en primer lugar, al estudio de la conexión entre ambas vías durante la regeneración hepática y el carcinoma hepatocelular en el modelo in vivo. Por otro lado, en el modelo in vitro, pretendimos analizar esta conexión relacionada con efectos protumorogénicos, tales como la adhesión y la migración de las células tumorales. Finalmente, se ha evaluado la relevancia traslacional de los resultados obtenidos, analizando la expresión génica de tejidos tumorales y no tumorales procedentes de pacientes de HCC. Los resultados obtenidos en el modelo in vivo muestran que los ratones que expresan la forma truncada del EGFR en los hepatocitos presentan un retraso en el proceso de la regeneración hepática tras una hepatectomía parcial (HP) y en la aparición de tumores inducidos tras inyectar el carcinógeno dietilnitrosamina (DEN). La falta de la actividad catalítica del EGFR promueve la activación de la vía del TGF-β durante la regeneración hepática, hecho que correlaciona con la inducción de la expresión de inhibidores del ciclo celular, tales como Cdkn1a (p21) y Cdkn2b (p15). La señalización de la vía del EGFR se muestra asimismo, necesaria para la acumulación de gotas lipídicas y para la expresión de un perfil adipogénico concreto durante la regeneración hepática, sugiriendo un papel relevante para el EGFR en el metabolismo lipídico del hígado. Sin embargo, a pesar de todas estas alteraciones, la vida de los ratones transgénicos no se ve comprometida de manera significativa, y los animales son capaces de regenerar el hígado completamente. La sobreactivación de la vía del factor de crecimiento hepático (HGF)/Met y la hiperplasia de las células restantes podría contribuir al éxito en el proceso regenerativo. Por otro lado, durante la tumorogénesis inducida por DEN, el retraso en la aparición de los tumores cuando la actividad catalítica del EGFR está atenuada no correlaciona con una mayor expresión de Tgfb1 o la sobreactivación de la vía de las Smads. No obstante, se observa una significativa mayor expresión de Nox4, diana de TGF-β y un inhibidor de la proliferación celular en el hígado. En relación al modelo desarrollado in vitro, se observa que los efectos del TGF-β sobre el fenotipo de EMT y en las capacidades migratorias de las células de CHC son heterogéneos. Así, la línea celular Hep3B responde induciendo una EMT total, mientras que la línea celular PLC/PRF/5 experimenta una EMT parcial, incrementando marcadores mesenquimales, pero manteniendo la expresión de E-cadherina y las adhesiones célula-célula. El silenciamiento del EGFR disminuye las adhesiones célula-célula en PLC/PRF/5 y en Hep3B. Sin embargo, tan solo es capaz de disminuir la adhesión a la matriz en el caso de PLC/PRF/5, pero no en Hep3B. Todos estos efectos conllevan a que el silenciamiento del EGFR provoque una migración de tipo ameboide inducida por TGF-β en PLC/PRF/5 (pero no en Hep3B), hecho que correlaciona con una mayor contractilidad de la actomiosina y ventajas en la migración celular. Por último, los análisis en tejidos tumorales de pacientes con HCC revelan que la mayoría de ellos presenta una activación de la vía del TGF-β y menores niveles de expresión del EGFR. No obstante, no hay correlación entre la expresión de TGFB1 y EGFR, sugiriendo que podrian regularse por mecanismos independientes. Finalmente, señalar que el perfil genético relacionado con EMT en aquellos pacientes de HCC que expresan niveles altos de TGFB1 está asociado a la expresión del EGFR, de forma que en tumores con niveles bajos del EGFR se observa baja expresión de CDH1 y alta expresión de VIM. En conjunto , nuestros resultados indican que la vía del EGFR juega papeles esenciales en la proiferación de los hepatocitos bajo situaciones fisiológicas como la regeneración hepática, regulando, entre otros procesos, la respuesta celular a los efectos supresores del TGF-β. Durante la carcinogénesis, en etapas tempranas puede contribuir a la aparición de nódulos preneoplásicos, pero una vez se ha formado el tumor, la vía del EGFR podría contrarrestar algunas de las señales pro-migratorias e invasivas del TGF-beta. Por consiguiente, es necesario profundizar en los mecanismos de conexión entre ambas vías, con el fin de atacarlas terapéuticamente. La estratificación de los pacientes de acuerdo a su expresión génica puede ayudar en la aplicación de las terapias mas adecuadas. Esta tesis aporta información acerca de algunos biomarcadores que podrían ser utilizados con este fin.