Viabilidad de vasos arteriales sometidos a procesos de criopreservación

Resumen

El material autólogo es el primer candidato elegido en técnicas de cirugía de revascularización o reconstrucción arterial, ya que ha presentado los mejores resultados especialmente en vasos de pequeños y mediano calibre. En aquellos pacientes que no disponen de vasos útiles o cuando los materiales protésicos no puden ser empleados para realizar técnicas de injerto o bypass, surge el problema de la sustitución arterial. En estas situaciones, una de las alternativas que se tienden a barajar actualmente es el empleo de vasos sometidos previamente a un proceso de criopreservación, almacenados a temperaturas utlra bajas. La viabilidad de estos vasos depende de muchos factores, entre ellos el medio de la congelación, la utilizació o no de crioprotectores, el protcolo de criopreservación, la temperatura de almacenamiento y el método de descongelación, entre otros. El objetivo de nuestro trabajo ha sido evaluar la viabilidad y los cambios morfológicos que se producen sobre los vasos tras el proceso de criopreservación y describir un protocolo de congelación/descongelación que mejore el rendimiento de las arterias destinadas a trasplante. En el estudio se utilizaron fragmentos de una longitud de 6.5 +- 0.5 cm de arterias ilíacas comunes de cerdos Mini-Pig (n=90). Se establecieron los distintos grupos de estudio en función de los siguientes parámetros; medio de criopreservación: Minimun Esential Medium (MEM)/Solución de la Universidad de Wisconsin (UW), temperatura de almacenamiento: -80ºC/- 145ºC/-196ºC y protocolo de descongelación: rápida (37ºC en baño)/lenta (aumentando la temperatura 1ºC/min). El tiempo de conservación de los fragmentos arteriales fue de 30 días en todos los casos. El proceso de congelación se realizó disminuyendo la temperatura a razón de 1ºC/min en un congelador biológico (Congelador Biológico CM-25; Carburos Metálicos SA). Los medios de criopreservación fueron suplementados con 20% de suero fetal bovino y 10% de dimetil sulfóxido (DMSO) como agente crioprotector. Se estudió, macroscópicamente, el índice de fracturas espontáneas y se procesaron las muestras para su posterior estudio a microscopía óptica y microscopía electrónica del barrido y transmisión. El grado de daño celular en cada una de las capas, se estudió mediante ultraestructura y técnica TUNEL. Se realizaron estudios inmunohistoquímicos para comprobar el estado de los componentes de la matriz extracelular. La resistencia y elasticidad de los vasos tras la criopreservación, fueron analizadas mediante estudios biomecánicos. Como grupo control, se utilizaron arterias ilíacas frescas suemrgidas en formol directamente o bien en los distintos medios de criopreservación utilizados con o sin solución crioprotectora. De manera general, la criopreservación producía en todos los grupos de estudio, áreas de denudación endotelial, conservando una buena celularidad de la capa media y provocando vacuolización citoplásmica de las células de ésta. No se observaron diferencias atribuibles al medio de criopreservación utilizado. Las arterias conservadas a -80ºC presentaron mayores daños celulares que las conservadas a menor temperatura. En cuanto al proceso de descongelación, el índice de fracturas espontáneas fue mayor para los grupos de arterias sometidas a descongelación rápida, y no existieron fracturas macroscópicas en los ejemplares sometidos a descongelación lenta. La observación a microscopía óptica mostró la aparición de grandes áreas de edema tisular en aquellas arterias descongeladas a 37ºC, coincidiendo con la mayor aparición de microfracturas. Se observó una cubierta endotelial más homogénea y una cpa media menos desorganizada en aquellas arterias sometidas a un proceso lento de descongelación. La microscopía electrónica de transmisión evidenció la existencia de daño celular en ambos protocolos de descongelación, traducidos en la existencia de vesicul citoplasma y aparición de daños nucleares, confirmando las observaciones obtenidas mediante TUNEL. El mayor grado de daño fue observado en aquellas arterias sometidas a un proceso rápido de descongelación. En cuanto al estado de la matriz extracelular, la expresión del compoenente elástico se veía disminuida en la capa media de aquellos especimenes sometidos a descongelación rápida. Los estudios inmunohistoquímicos, mostraron un aumento de la expresión de MMP2 tras la congelación en los mismos grupos de descongelación rápida. Desde el punto de vista biomecánico, el proceso de criopreservación/descongelación no alteraba la resistencia a la tracción ni la viscoelasticidad de las arterias. En base a estos resultados podemos establecer las siguientes conclusiones; los medios de criopreservación empleados no influían en el mantenimiento y conservación de arterias criopreservadas destinadas a trasplante. La temperatura de almacenamiento en nitrógeno, tanto en fase de vapor como en fase líquida, mejora los resultados observados con el mantenimiento a -80ºC. El proceso de descongelación lenta evita la aparición de áreas de edema, la formación de fracturas macroscópicas espontáneas y mejora la estructura y funcionalidad de las arterias criopreservadas. Por todo ello, hoy en día, el protocolo más idóneo para el mantenimiento de fragmentos arteriales destinados a transplante debería ser; criopreservación de las muestras en MEM/UW + 10% DMSO disminuyendo la temperatura 1ºC/min; almacenamiento a temperatura comprendida entre -145ºC y -196ºC , y proceso de descongelación gradual, con un rango de incremento de la temperatura de 1ºC/min, hasta alcanzar la temperatura ambiente.