Papel de los RNAs no-codificantes de proteínas en el metabolismo lipídico intestinal

Resumen

Los microRNAs (miRNAs) son elementos clave en la modulación de la expresión génica a nivel postranscripcional. Aunque su papel en la regulación del metabolismo del colesterol y lípidos en diferentes tejidos se ha determinado con anterioridad, su conocimiento a nivel intestinal todavía es limitado. En este trabajo investigamos la importancia de los miRNAs a nivel intestinal utilizando un modelo de ratón knockout para Dicer1 específico de intestino, evaluándose el papel de los miRNAs en el enterocito y el metabolismo lipídico. Para ello se realizó un análisis de la expresión génica por PCR a tiempo real utilizando un array de genes implicados en el metabolismo de lipoproteínas y colesterol, observándose una disminución de la mayoría de genes, exceptuando Soat-1, Olr-1 y Hmgcs2. El estudio de la expresión proteica mediante Western blot para estos tres genes confirmó el aumento observado para OLR-1 y HMGCS2. Mediante diferentes herramientas informáticas se identificaron miRNAs candidatos para su evaluación, y que tienen como diana estos genes. Por otro lado se caracterizó el modelo animal KO que presentó un menor peso, una disminución en los marcadores del mantenimiento y estado de maduración del intestino, así como una alteración en el procesamiento de los triglicéridos de la dieta. Paralelamente estudiamos los posibles miRNAs regulados por una dieta hipercalórica y en condiciones de lipemia postprandial, utilizando animales macho wild type para la realización de un screening a diferentes tiempos de exposición. Las condiciones de lipemia postprandial se recrearon con una carga oral de aceite de oliva enriquecido con colesterol (¿Pulse¿), mientras que para los tratamientos a corto y largo plazo se administró una dieta hipercalórica a los animales durante 4 días (¿Short¿) y 20 semanas (¿Long¿) respectivamente. Utilizando paneles de miRNAs maduros se realizó el screening en las muestras de intestino delgado de los 3 experimentos. De los miRNAs diferencialmente expresados en base al tratamiento seleccionamos 44 microRNAs. La cinética de expresión de estos microRNAs se estudió en muestras de intestino delgado de machos WT, obtenidas a diferentes tiempos tras realizar una carga oral con aceite de oliva enriquecido en colesterol. Acotamos los tiempos de experimentación a dos y cuatro horas, y seleccionamos 9 miRNAs candidatos. A su vez, el estudio de la expresión de miRNAs por RNA-Seq en enteroides tratados nos llevó a la selección de 3 candidatos adicionales para su validación. En la primera cohorte de validación, a 2 horas tras la carga oral, detectamos diferencias de expresión en función del sexo y una variabilidad que nos llevó a considerar el estudio en las diferentes secciones intestinales. Así, analizamos la expresión de los microRNAs seleccionados en machos y hembras a 2 y 4 horas, diferenciando el intestino delgado en duodeno, yeyuno, e íleon, e incluyendo el colon e hígado para su comparación. A continuación, se evaluaron los candidatos en modelos in vitro utilizando células Caco-2 diferenciadas y enteroides. La respuesta a lípidos postprandiales de los 13 candidatos en estos modelos difirió a la observada in vivo. Pese a que Caco-2 y enteroides constituyen aproximaciones in vitro valiosas, han de considerarse las debilidades de ambos modelos para analizar los resultados obtenidos y seguir realizando modificaciones sobre ambos modelos para recrear más fielmente las condiciones fisiológicas. Aunque existe una variabilidad en los resultados de expresión entre los diferentes modelos estudiados en la presente tesis, lo cual reduce la posibilidad de establecer candidatos firmes que respondan a lípidos de manera robusta, concluimos que los lípidos de la dieta modifican algunos miRNAs del intestino posiblemente implicados en la regulación del metabolismo lipídico.