Caracterización de mecanismos moleculares asociados a la resistencia de células de melanoma a compuestos inhibidores de la vía de las MAP quinasas

Resumen

El melanoma es un tumor maligno de melanocitos asociado mayoritariamente a mutaciones que causan la activación de la vía de señalización MAPK, como la mutación BRAFV600E. El tratamiento con inhibidores específicos de BRAFV600E como el vemurafenib, y la combinación de estos con inhibidores de MEK como el trametinib, ha permitido incrementar la supervivencia de los pacientes. Sin embargo, la reactivación de la vía MAPK reduce considerablemente la eficacia de estos inhibidores y da lugar a resistencia, lo cual ha llevado al desarrollo de inhibidores de ERK que permitan una mayor supresión de la activación de esta vía. No obstante, la experiencia con los inhibidores de BRAF y MEK sugiere que el desarrollo de mecanismos de resistencia a los inhibidores de ERK es esperable. Por otra parte, varios estudios muestran que la respuesta a estas terapias dirigidas puede estar limitada por alteraciones no genómicas, y resultados previos del laboratorio indican la contribución de los microRNAs miR204 y miR211 en la resistencia a vemurafenib. OBJETIVOS ¿ Generación y caracterización de líneas celulares de melanoma con resistencia simple al inhibidor de ERK SCH772984, y con resistencia doble a vemurafenib y trametinib o vemurafenib y SCH772984. ¿ Identificación de alteraciones en rutas de señalización en las células resistentes, y determinación de su implicación en las resistencias. ¿ Análisis de la regulación de la expresión de miR204 y miR211 en células de melanoma resistentes a vemurafenib, e identificación de sus dianas proteicas. RESULTADOS Para la generación de las células resistentes, se emplearon las líneas celulares de melanoma humano A375 y SKMel28. Las células resistentes a SCH772984 o a las combinaciones de vemurafenib y trametinib o vemurafenib y SCH772984 mostraron menores niveles de fosforilación de ERK que las células parentales, lo cual estaba compensado por un incremento en la activación de Erk5, permitiendo así su supervivencia y proliferación. La fosforilación de Erk5 en las células resistentes es dependiente del receptor tirosina quinasa IGF1R, cuya expresión y activación se encuentra aumentada en estas células. De esta manera, mostramos que la inhibición de IGF1R reduce la activación de Erk5 y disminuye el crecimiento en ratones de tumores derivados de células resistentes. Por otra parte, el análisis comparativo de la expresión de factores de crecimiento reveló una menor expresión de TGFalfa en las células resistentes que en las parentales, y la incubación de las células resistentes con TGFalfa o con medio condicionado por las células parentales permite la recuperación de la fosforilación de ERK. Para el tercer objetivo se utilizaron células A375 resistentes a vemurafenib y células A375 que sobreexpresaban miR204 y miR211, generadas con anterioridad en el laboratorio. El análisis de la regulación de la expresión de ambos miRNAs reveló que el factor de transcripción STAT3 contribuye al incremento de expresión de miR204 en las células resistentes, mientras que la expresión de miR211 parece ser independiente de MITF en estas células. Finalmente, mostramos que el aumento de miR211 correlaciona con la disminución de los niveles de sus dianas NUAK1 y CHOP. CONCLUSIONES La resistencia a inhibidores de la vía MAPK está mediada por la activación de IGF1R y Erk5, permitiendo la supervivencia en presencia de baja activación de ERK en células de melanoma. La disminución de la expresión de TGFalfa contribuye al mantenimiento de la inhibición de ERK en células resistentes. Nuestros resultados sugieren que la inhibición de IGF1R y Erk5 constituye una estrategia terapéutica potencial en melanoma. Por otra parte, hemos mostrado que STAT3 induce la expresión de miR204 en células A375 resistentes a vemurafenib, e identificado NUAK1 y CHOP como dianas de miR211 en estas células, las cuales podrían mediar dicha resistencia.