Identificación y caracterización de glicosil hidrolasas en Lactobacillus plantarum WCFS1

Resumen

Los carbohidratos son los compuestos orgánicos más abundantes en los alimentos después del agua, además de ser los más ampliamente distribuidos. Se pueden presentar bajo las formas de monosacáridos, oligosacáridos o polisacáridos desempeñando una función estructural, nutricional, defensiva y como material de desecho. Son compuestos frecuentes en alimentos de origen vegetal debido a que se originan en procesos derivados de la fotosíntesis y tienen gran importancia en alimentación debido a su carácter energético y a su influencia sobre algunas propiedades sensoriales de los alimentos. Lactobacillus plantarum es una especie de bacteria láctica que se encuentra en una amplia variedad de nichos con alto contenido en carbohidratos. El análisis de la secuencia del genoma de la cepa L. plantarum WCFS1 permitió identificar 55 proteínas anotadas en la base de datos CAZy como ¿glicosil hidrolasas¿ (GH) y que posiblemente estaban implicadas en el metabolismo de carbohidratos. Sin embargo, la mayoría de las proteínas presentes en las bases de datos no se han caracterizado experimentalmente. Los objetivos específicos de esta tesis doctoral son: 1. Estudio de la capacidad metabólica de L. plantarum WCFS1 sobre carbohidratos. 2. Identificación y caracterización bioquímica de glicosil hidrolasas en L. plantarum WCFS1. 3. Relevancia de estas glicosil hidrolasas en el fenotipo de L. plantarum WCFS1. 4. Análisis in silico de la presencia/ausencia de glicosil hidrolasas en distintas cepas de la especie L. plantarum y de otras especies pertenecientes al grupo plantarum. En este trabajo se ha realizado la identificación y caracterización de un elevado número de las proteínas anotadas como glicosil hidrolasas en L. plantarum WCFS1. Estas proteínas pertenecen a seis familias distintas de glicosil hidrolasas (GH1, GH13, GH32, GH36, GH42 y GH78). Las proteínas caracterizadas presentan once diferentes actividades hidrolíticas sobre carbohidratos derivados de p-nitrofenilo entre las que se incluyen actividad ¿-Dmaltosidasa, ¿-D-glucosidasa, 6-P-ß-D-glucosidasa, ¿-D-maltopentaosidasa, ß- D-galactosidasa, ß-D-fucosidasa, ¿-L-arabinosidasa, ¿-L-ramnosidasa, ¿-Dgalactosidasa, 6-P-ß-D-galactosidasa y 6-P-ß-D-tioglucosidasa. La identificación de la actividad bioquímica de estas glicosil hidrolasas se ha intentado relacionar con el metabolismo de carbohidratos o con el crecimiento en diversas fuentes de carbono mostrado por esta cepa. Para ello se han construido cepas mutantes carentes de una determinada glicosil hidrolasa específica. Se ha comprobado que estas mutaciones afectan al perfil de utilización de algunos carbohidratos originando múltiples perfiles fenotípicos en las cepas mutantes. Los resultados obtenidos reflejan la importancia de las glicosil hidrolasas en la adaptación de L. plantarum WCFS1 mediante la ausencia y/o presencia en su genoma de determinados genes que codifican estas glicosil hidrolasas y que le confieren la capacidad para crecer y utilizar determinados carbohidratos. La realización de esta tesis ha contribuido a demostrar la compleja y variada batería de glicosil hidrolasas implicadas en el metabolismo de carbohidratos que posee L. plantarum WCFS1. Además, este trabajo ha permitido identificar un amplio abanico de actividades enzimáticas en L. plantarum WCFS1 que nos permite disponer de proteínas útiles para su potencial uso en la industria alimentaria.