Papel de TLR4 del neutrófilo en el ictus agudo experimental

Abstract

El sistema inmune es capaz de provocar una respuesta contra un estímulo de tipo no patógeno, lo que se denomina inflamación estéril. Las moléculas endógenas que se liberan cuando un tejido se daña pueden iniciar una respuesta inflamatoria mediante la activación de receptores como el TLR4 (del inglés, Toll-like receptor 4). Este receptor se expresa en los neutrófilos, además de en otras células circulantes. Los neutrófilos constituyen la primera línea de defensa del sistema inmune innato ya que son las primeras células en responder cuando se produce un proceso de inflamación aguda. La respuesta inmune subsecuente a un ictus isquémico es un factor crucial en la fisiopatología y la resolución del ictus. Se conoce que TLR4 está implicado en el daño cerebral y la inflamación después del ictus y que la ausencia de TLR4 induce la reprogramación neutrofílica hacia un fenotipo alternativo en isquemia cerebral, lo que concuerda con un papel diferencial de los neutrófilos en ausencia de TLR4. Con estos antecedentes, en la presente Tesis Doctoral, propusimos como hipótesis que el TLR4 neutrofílico es el responsable del daño inducido en el tejido cerebral después del ictus. Además, nos planteamos si la ausencia de TLR4 podría inducir la polarización del neutrófilo hacia el fenotipo N2, asociado con la neuroprotección. Finalmente, nos planteamos si la falta de TLR4 podría modificar las funciones del neutrófilo y, como consecuencia, alterar su contribución al proceso inflamatorio. Para el análisis transcriptómico se utilizaron ratones de fenotipo salvaje así como ratones TLR4KO. Para evaluar el papel del TLR4 neutrofílico en la neuroprotección tras ictus utilizamos ratones que no expresan TLR4 en las células mieloides (TLR4loxP/Lyz-cre) así como sus respectivos controles (TLR4loxP/loxP) en los que el volumen de infarto se determinó mediante imagen por resonancia magnética. El análisis estereológico se utilizó para determinar la infiltración de los neutrófilos y el fenotipo de los mismos. Además, se utilizó una combinación de citometría de flujo, microscopía confocal y microscopía intravital para evaluar las diferentes funciones neutrofílicas en ambos genotipos. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral demuestran, mediante el análisis transcriptómico de los neutrófilos con y sin TLR4, que el TLR4 neutrofílico modula la contribución de los neutrófilos a la inflamación inducida por la isquemia, la migración al parénquima y su funcionalidad. También, que la deficiencia específica de TLR4 en las células mieloides está involucrada en la neuroprotección después del ictus ya que el volumen de infarto de los ratones cuyos neutrófilos no expresan TLR4 es significativamente menor lo que es concomitante con un aumento en la infiltración de neutrófilos sin TLR4 en el tejido isquémico. Además, la ausencia de TLR4 reprograma los neutrófilos hacia un fenotipo N2. En homeostasis, la ausencia de TLR4 mantiene a los neutrófilos en un estado de ¿juventud¿ que se desregula, al menos en parte, tras un estímulo isquémico. Además, impide que los neutrófilos sigan su fluctuación circadiana normal. En relación a las funciones de los neutrófilos, aquellos que no expresan TLR4 muestran una actividad fagocítica mayor en el estado basal, son preferencialmente engullidos por la microglía tras el ictus, producen menos especies radicales de oxígeno en las primeras etapas del proceso inflamatorio y son más susceptibles de producir NETs in vitro pero no in vivo. Finalmente, en modelos inflamatorios fuera del SNC (sistema nervioso central) los neutrófilos que no expresan TLR4 se adhieren a los vasos e infiltran con menor eficiencia en el tejido. En conclusión, los resultados indican que TLR4 representa un papel fundamental en la polarización del neutrófilo, ya que su ausencia reprograma a los neutrófilos hacia un fenotipo N2 y modula la inducción de diferentes rutas asociadas con el proceso inflamatorio, así como altera distintas funciones neutrofílicas.