Implications of the microtubule cap structure in the molecular mechanism of paclitaxel

Resumen

Los microtúbulos son polímeros compuestos por alfa-beta heterodímeros de tubulina. Éstos son elementos clave del citoesqueleto y su función depende en gran medida de su dinámica de polimerización, siendo la inestabilidad dinámica su principal mecanismo. Ésta se basada en la existencia de un desacoplamiento entre la adición de un dímero de GTP-tubulina (que consiste en su estado propenso a polimerizar) y la hidrólisis de su molécula de GTP, pasando a un estado GDP-tubulina que tiende a despolimerizar. Dicho desacoplamiento implica la división del microtúbulo en dos áreas: un núcleo de GDP-tubulina inestable y un extremo ubicado en la punta de crecimiento compuesto de moléculas de GTP-tubulina y sus intermedios de hidrólisis (GDP-Pi-tubulina). El modelo actual del extremo de microtúbulos propone que GTP-tubulina se expande axialmente, lo que facilita contactos de alta energía que estabilizan al microtúbulo. En consecuencia, la pérdida del extremo tras la hidrólisis total de GTP produce la desestabilización del microtúbulo y su repentina despolimerización. Debido a su papel en funciones esenciales, los microtúbulos son un objetivo farmacológico importante en la terapéutica del cáncer, siendo el paclitaxel el fármaco dirigido a microtúbulos más utilizado. Éste se une al sitio de taxano en el microtúbulo, estabilizando su estructura y previniendo su despolimerización. Esta capacidad para alterar la dinámica de los microtúbulos está estrechamente relacionada con sus efectos antitumorales, pero el mecanismo molecular aún no está claro. No obstante, paclitaxel induce una estructura microtubular similar a la modelada previamente para la región GTP del extremo, lo que sugiere una relación bioquímica y estructural entre el estado nucleotídico y los efectos del paclitaxel en el microtúbulo. El presente trabajo aborda dos objetivos principales. En primer lugar, ampliar el conocimiento sobre el extremo del microtúbulo, mediante el uso de trifluoruro de berilio y fluoruro de aluminio como análogos del gamma-fosfato de GTP y GDP- Pi, respectivamente. En segundo lugar, describir la relación entre el estado nucleotídico de la tubulina y el mecanismo molecular del paclitaxel mediante el estudio de la interacción entre sus sitios de unión. Respecto al primer objetivo, los resultados muestran que éstos fluoruros se unen a tubulina de forma similar al gamma-fosfato natural e inducen la polimerización de tubulina y la estabilización de microtúbulos. Además, producen microtúbulos que no muestran una conformación expandida, previamente atribuida al extremo GTP de los microtúbulos. Dado que GMPCP, el análogo difosfato de GMPCPP, también induce una conformación expandida, el extremo de microtúbulos presenta una estructura completamente compacta, distinta a la propuesta hasta la fecha. Respecto al segundo objetivo propuesto, se observa que el sitio de unión de taxano y el sitio de unión de nucleótidos (sitio E) interactúan bioquímica y estructuralmente en tubulina curva en solución y en tubulina microtubular recta. El gamma-fosfato del nucleótido controla los efectos del paclitaxel en la estructura del microtúbulo, ya que los análogos de fosfato empleados impiden la expansión axial inducida por paclitaxel. Por tanto, los efectos de paclitaxel observados en el microtúbulo requieren un estado de GDP de tubulina. Además, Flutax-2, un análogo de paclitaxel fluorescente, muestra una cinética de unión más rápida a microtúbulos-GMPCPP expandidos, lo que indica que el estado nucleotídico del microtúbulo es determinante en la farmacología de los taxanos. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis sugieren que el extremo de los microtúbulos muestra una conformación completamente compacta. Sin embargo, las características de la interacción entre el paclitaxel y el sitio de unión de nucleótidos sugieren la existencia de un estado transitorio expandido, probablemente involucrada en la liberación de Pi posterior a la hidrólisis de GTP.