Protein-kinase inhibitors as potential leishmanicidal drugs

Resumen

La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria causada por especies del género Leishmania. Su transmisión es vectorial y principalmente zoonótica, pero es antroponótica en zonas endémicas con alta densidad humana. Debido a diversos factores, incluyendo el aumento de viajes por todo el mundo y la ampliación de la distribución geográfica del vector flebotomo favorecida por el calentamiento global, la prevalencia de la leishmaniasis ha aumentado en las últimas décadas. Dado que las vacunas humanas contra la enfermedad se encuentran aún en desarrollo, el tratamiento principal para la leishmaniasis recae en la quimioterapia. Sin embargo, los fármacos en uso presentan problemas de costes, toxicidad y aparición de resistencias. Para solucionar tales inconvenientes, la búsqueda de nuevos tratamientos farmacológicos se basa en dos estrategias principales: Terapias de combinación con los fármacos disponibles, o descubrimiento de nuevos compuestos mediante tres posibles aproximaciones: reposicionamiento de fármacos, cribados fenotípicos y cribados dirigidos a diana. Debido por tanto a la necesidad actual, el principal objetivo de esta tesis es el descubrimiento de nuevos agentes leishmanicidas con un mecanismo de acción definido. Para ello, se han evaluado distintos grupos de compuestos orgánicos de bajo peso molecular mediante la combinación de un cribado enfocado en la inhibición de la isoforma corta de la GSK-3 de L. donovani (LdGSK¿3s) y un cribado fenotípico en promastigotes y amastigotes axénicos. Además, se ha evaluado el efecto de los compuestos activos en distintos parámetros bioenergéticos para definir su efecto en la homeostasis intracelular de parásito y explorar posibles dianas adicionales. La proteín-quinasa (PQ) GSK-3s es una de las pocas dianas esenciales en Leishmania validadas farmacológicamente, junto con las PQs CK1.2 y MAPK4. Tras expresar y purificar LdGSK-3s, se seleccionaron 4 grupos de compuestos provenientes de la quimioteca del grupo de investigación. El Grupo 1 consistió en inhibidores de PQs humanas, mientras que los Grupos 2, 3 y 4 se originaron a partir de cribados virtuales enfocados en cada una de las tres PQs validadas mencionadas. Adicionalmente, se seleccionaron los Grupos 1.1 y 2.1 con compuestos procedentes de la optimización de los mejores compuestos activos de los Grupos 1 a 4. En total se han evaluado 136 compuestos, e identificado 14 inhibidores de LdGSK-3s con actividad leishmanicida (hits), pertenecientes a tres familias químicas diferentes (tiadiazolidindionas, halometilcetonas y quinonas). De estos hits, 5 mostraron un buen índice de selectividad (mayor que 10), y 4 fueron identificados como los primeros inhibidores específicos de la GSK-3s de Leishmania, sin inhibición cruzada con la GSK-3beta humana, su homólogo humano más cercano. También se identificó el modo de unión a la LdGSK-3s de las tiadiazolidindionas y las halometilcetonas a través de unión covalente a la Cys169 LdGSK-3s. Por otro lado, se evaluó la efectividad de los 14 compuestos en amastigotes intracelulares, obteniendo una disminución de la carga parasitaria de macrófagos infectados estadísticamente significativa para 5 de ellos. Finalmente, se evaluó el efecto de los hits en el metabolismo energético de promastigotes de Leishmania. Se identificaron 4 compuestos con diana en la cadena respiratoria del parásito, induciendo colapso bioenergético y consecuente apoptosis. Así, la combinación del cribado enfocado en la GSK-3s de Leishmania y el cribado fenotípico sobre el parásito ha permitido identificar nuevos compuestos con potencial leishmanicida pertenecientes a nuevas familias químicas para el desarrollo de fármacos contra la leishmaniasis. Además, se ha identificado el mecanismo multi-diana de algunos de los compuestos, con inhibición no sólo sobre la GSK-3s sino también sobre la cadena respiratoria del parásito. Dicho efecto incrementa su potencial farmacológico al dificultar la aparición de resistencias contra los mismos