High resolution studies of R2TP, an HSP90 cochaperone involved in spliceosome assembly

Resumen

HSP90 es una chaperona molecular clave para el ensamblaje, estabilización y regulación de muchas otras proteínas y complejos biológicos. Es una proteína muy ubicua que representa el 1-2% del proteoma global. Además, alrededor del 10% del proteoma total interactúa con HSP90 (clientes de HSP90). La gran cantidad de clientes HSP90 no relacionados entre sí sugiere que HSP90 actúa de una manera muy versátil. De hecho, se sabe que HSP90 es capaz de adaptarse a muchos clientes diferentes en múltiples conformaciones, incluidos estados parcialmente plegados. Esta flexibilidad se explica en parte por la existencia de múltiples cochaperonas que son proteínas accesorias que regulan la actividad de HSP90 y proporcionan una amplia variedad de puntos de anclaje para los diferentes clientes de HSP90. El complejo R2TP es una de estas cochaperonas HSP90 que proporciona especificidad y además sirve de plataforma flexible para el ensamblaje y estabilización de muchos complejos biológicos importantes. Estos incluyen PIKKs, U5 snRNP, Pol II, MRN, L7Ae RNP y TSC. En los seres humanos, R2TP se compone de RUVBL1, RUVBL2, RPAP3 y PIH1D1. Además, R2TP también es parte de un complejo cochaperona más grande conocido como PAQosoma que incluye R2TP y el módulo PFDL.En este trabajo hemos utilizado criomicroscopía electrónica de alta resolución (cryo-EM) para investigar el papel de R2TP como plataforma para reunir HSP90 con algunos clientes específicos. Descubrimos que RPAP3 proporciona un enlace flexible entre HSP90 (y probablemente también HSP70), PIH1D1 (subunidad para reclutamiento de clientes) y el hexámero RUVBL1-RUVLB2 (AAA+ ATPasa como fuente de energía para el sistema). RPAP3 se extiende en ambas caras del hexámero RUVBL1-RUVBL2. En la cara ATPasa encontramos el dominio RPAP3 C-ter, que proporciona un anclaje estable para unir RPAP3 y RUVBL2. En la cara DII encontramos el resto de la proteína RPAP3 y PIH1D1 unidas de manera flexible al anillo RUVBL1-RUVBL2.Nuestro mapa de microscopía de alta resolución de R2TP nos reveló tres densidades que inicialmente denominamos RBD y que luego identificamos como el dominio RPAP3 C-ter. Dado que la resolución de esta parte del mapa no alcanzó consistentemente la barrera de los 4 Å, la interpretación de esta densidad RBD fue una tarea desafiante que hemos abordado en esta tesis doctoral. Las coordenadas de RMN del mismo dominio publicadas más tarde por otro grupo presentaron solo diferencias menores en comparación con nuestro modelo RPAP3 C-ter, validando no solo nuestro modelo atómico sino también la utilidad de nuestra estrategia de modelado.Para la última parte de esta tesis, investigamos el papel de varios adaptadores R2TP en el ensamblaje de la partícula de espliceosoma U5 snRNP. Clonamos, expresamos y purificamos AAR2, ECD y ECD coexpresado con la quinasa CK2. En combinación con muchas otras proteínas relacionadas con esta vía con las que trabajamos actualmente en nuestro laboratorio (RUVBL1, RUVBL2, RPAP3, PIH1D1, ZNHIT2, AAR2, ECD y PRPF8), tenemos una interesante colección de proteínas para empezar a abordar la ruta de ensamblaje de U5 snRNP. Nuestros experimentos preliminares sugieren que podemos reconstituir un potencial subcomplejo RUVBL1-RUVBL2-ZNHIT2-AAR2-PRPF8, lo que revela por primera vez cómo está mediada la conexión entre PRPF8 (el núcleo de U5 snRNP) y RUVBL1-RUVBL2. Este es probablemente solo uno de los múltiples complejos de transición necesarios para el ensamblaje de U5 snRNP. Creemos que podemos reconstituir más de estos complejos de transición con la participación del resto de componentes del ensamblaje y gracias a esto explicar mejor la ruta de ensamblaje de U5 snRNP y el papel de los diferentes adaptadores. Para ello, nuestra técnica de elección es la criomicroscopía de alta resolución (cryo-EM), donde no solo podemos estudiar diferentes complejos en solución, sino también clasificar la potencial heterogeneidad de nuestros intermediarios de ensamblaje de U5 snRNP reconstituidos in vitro.