Diseño de variantes optimizadas de inmunotoxinas basadas en ribonucleasas fúngicasefecto antitumoral in vitro e in vivo

Resumen

Las inmunotoxinas son biomoléculas quiméricas con aplicaciones terapéuticas que combinan la especifidad de un anticuerpo para reconocer y unirse a antígenos con la actividad citotóxica de una toxina. Su estructura consta de un dominio marcador, generalmente un anticuerpo o fragmento del mismo, que dirige la acción de un dominio tóxico o efector, que está compuesto por una toxina cuya actividad enzimática, una vez en el interior celular, provoca la muerte de la célula diana. Así, su mecanismo de acción implica el reconocimiento por parte del dominio marcador del antígeno tumoral presente en la superficie de la célula diana, la internación del complejo, y la posterior liberación del dominio tóxico en el interior celular que produce la muerte celular por su actividad tóxica. Por tanto, su elevada especifidad y potencia citotóxica, y la ausencia de mecanismos de resistencia específicos han convertido a las inmunotoxinas en potenciales agentes biológicos terapéuticos en el tratamiento del cáncer u otras enfermedades. Desde la aparición de las primeras inmunotoxinas, las nuevas construcciones han evolucionado en cuanto a su diseño, producción, estabilidad y eficacia, minimizando las limitaciones y efectos secundarios observados en los primeros ensayos, como su elevada inmunogenicidad, gran tamaño molecular, corta vida media o la citotoxicidad inespecífica en células sanas. Gracias a ello, en los últimos años ha resurgido el interés en el estudio y desarrollo de nuevas inmunotoxinas para su aplicación clínica. Actualmente, tres de ellas han sido aprobadas por la FDA para el tratamiento de distintos cánceres hematológicos. Sin embargo, aún no ha sido aprobado ningún tratamiento clínico para tumores sólidos basado en inmunotoxinas. Con esta perspectiva, las investigaciones actuales se centran en la optimización de los diseños para mejorar sus propiedades farmacocinéticas, aumento en la capacidad de penetración en tumores sólidos y búsqueda de nuevas dianas terapéuticas, no solo para el tratamiento del cáncer, sino también para afecciones alérgicas, inflamatorias o parasitarias. En la presente Tesis doctoral, se expone el trabajo realizado en el desarrollo y caracterización estructural y funcional de nuevos diseños optimizados de inmunotoxinas recombinantes basadas en la fusión de los dominios variables en cadena única del anticuerpo monoclonal A33 (scFvA33), que reconoce el antígeno GPA33, sobreexpresado en cáncer colorrectal, con dos RNasas fúngicas: la ribotoxina ¿-sarcina y la RNasa T1. Los objetivos planteados en esta Tesis se han dividido en dos bloques independientes: A) Profundización de los estudios sobre el efecto antitumoral in vivo de la IMTXA33¿S, incluyendo la caracterización a nivel molecular de los tumores tratados, así como el efecto del tratamiento combinado de dos inmunotoxinas con distinta diana antigénica en la misma célula diana. B) Producción y caracterización de nuevos diseños optimizados de inmunotoxinas dirigidos a un incremento de su eficacia citotóxica. Para ello, se han seguido dos estrategias diferentes: B.1) Incorporación de un sitio de reconocimiento de la proteasa intracelular furina, para favorecer la liberación del dominio tóxico al citosol, obteniéndose las variantes IMTXA33fur¿S y scFvA33furT1. B.2) Obtención de una inmunotoxina con formato trimérico, IMTXTriA33¿S, que debería mostrar un incremento en su avidez y carga tóxica.