Quantitative imaging in 3D microscopy with partially coherent illumination

Resumen

El principal objetivo de esta tesis doctoral es desarrollar e implementar una técnica rápida, económica y no invasiva (sin marcadores químicos) para obtener la imagen cuantitativa 3D de muestras de absorción débil en microscopios convencionales de transmisión de campo amplio. Dicha técnica se enmarca en la tomografía de difracción óptica (TDO) que permite reconstruir el índice de refracción (IR) en 3D de una muestra. Durante los últimos 10 años varias configuraciones de microscopios holográficos que aplican la TDO con la iluminación láser de la muestra han sido propuestas e incluso comercializadas. El enfoque de esta tesis es ofrecer una alternativa competitiva a las técnicas interferométricas de la TDO implementadas con la iluminación coherente (TDO-C) que sea compatible con microscopios convencionales e iluminación parcialmente coherente (TDO-PC). La TDO-PC es más simple y rápida, ya que evita los complejos procesos de escaneo de la muestra requeridos en TDO-C, seguidos de una reconstrucción de fase y ensamblado de datos, que consumen mucho tiempo. Además, la iluminación parcialmente coherente espacialmente evita el ruido speckle y otros artefactos característicos de la iluminación coherente. La tesis abarca los siguientes temas: 1. Establecimiento de un marco teórico para obtener tomografía de IR de alta resolución a partir de un conjunto de imágenes de intensidad obtenidas por un único escaneo de una muestra, junto con el desarrollo de los algoritmos y software necesarios. Este trabajo incluye: el análisis de la función de transferencia óptica (FTO), el diseño de una iluminación apropiada para mejorar el contraste de las frecuencias transmitidas por el microscopio, la elección de un método de deconvolución adecuado y la verificación numérica del esquema de reconstrucción propuesto. Hemos hallado que reemplazando la iluminación de campo claro por una iluminación gaussiana se equilibran mejor las bajas y altas frecuencias de la muestra, lo que proporciona una FTO más uniforme y mayor fiabilidad de la reconstrucción del IR en 3D. Dicha iluminación gaussiana se consigue fácilmente incorporando un filtro apodizador comercial en el microscopio. Asimismo, se ha demostrado que el uso de FTO más realistas, calculadas considerando las condiciones reales de iluminación (midiendo la distribución de intensidad en el plano de la apertura del condensador del microscopio) mejora significativamente la calidad de la reconstrucción del IR. 2. Implementación experimental de TDO-PC, por medio de un montaje experimental económico y compatible con microscopios de campo amplio; y al mismo tiempo lo bastante rápido para reconstruir el IR en 3D de micro-objetos dinámicos a velocidad de vídeo. La implementación experimental de TDO-PC comprende un microscopio de campo amplio, unido a un módulo de reenfoque óptico. Dicho módulo consta de una lente de focal ajustable eléctricamente, que proporciona un escaneo óptico axial a gran velocidad limitado sólo por la velocidad de la cámara. Las prestaciones de este montaje experimental han sido testadas con micro-objetos dinámicos tales como células vivas, incluso ópticamente manipuladas (transportadas) utilizando pinzas ópticas no convencionales. Se ha mostrado también que TDO-PC permite analizar la dinámica intracelular. 3. Aplicación de la técnica TDO-PC a problemas del mundo real en medicina y biofísica. La validez de TDO-PC ha sido demostrada con reconstrucciones de muestras biológicas (bacterias, diatomeas, sangre, HeLa, fibroblastos, etc.). También se ha logrado identificar patologías en células a partir de variaciones de su IR (parasitosis de macrófagos afectados por Leishmania o daños en mitocondrias de hepatocitos inducidos por farmacología); así como monitorizar variaciones de densidad de masa seca celular durante procesos biológicos (necrosis, etc.). En conclusión, prevemos que TDO-PC servirá para el estudio de IR en 3D de muestras (células) fijadas o vivas, en futuras aplicaciones en tiempo real.