Bases moleculares de las neoplasias mieloproliferativas crónicas filadelfia negativas

Resumen

Las neoplasias mieloproliferativas (NMP) cromosoma Filadelfia negativas clásicas, Policitemia Vera, Trombocitemia Esencial y Mielofibrosis Primaria son trastornos clonales de la célula madre hematopoyética caracterizados por la proliferación de una o más líneas mieloides. El papel que las mutaciones en genes no driver juegan en la biología y pronóstico de estas enfermedades así como los mecanismos a través de los cuales diversas variantes genéticas identificadas incrementan el riesgo de padecer NMP no están bien estudiados. Los objetivos de esta tesis fueron evaluar la utilidad de la secuenciación de un panel de genes implicados en patología mieloide en el diagnóstico y pronóstico de estas entidades, su aportación en el conocimiento de la biología de las mismas y el estudio mediante nuevas técnicas de biología molecular de variantes que aumentan el riesgo genético de padecer NMP. Para ello se recogieron datos de 140 pacientes con sospecha o diagnóstico de NMP a los que se les había realizado secuenciación de un panel de genes relacionado con patología mieloide, se realizaron estudios duales de actividad de luciferasa para estudiar la actividad transcripcional de STAT5 además de estudios de proliferación para estudiar los efectos de algunas mutaciones detectadas, se realizó secuenciación de exomas en una familia con trombocitosis familiar y en dos con NMP familiar y se realizaron experimentos 4C-seq para estudiar el plegamiento e interacciones diferenciales del haplotipo 46/1, implicado en el riesgo genético de padecer NMP. Se observó una asociación entre presentar mutaciones y padecer alguna patología mieloide a expensas de mutaciones con utilidad clínica y con la presencia de mutaciones en genes de tirosinas cinasas, modificadores epigenéticos y aquellos implicados en splicing. En NMP se encontró asociación entre progresión y la presencia de mutaciones por NGS, mutaciones en tirosinas cinasas y sus vías, en genes de modificadores epigenéticos y genes DAT (DNMT3A, ASXL1 y TET2). Los genes asociados fueron ASXL1, CALR y TET2. La presencia de mutaciones clasificadas como con significado clínico también se asoció a progresión, así como el número de mutaciones, esto último en el análisis multivariante. En el análisis de tiempo a progresión, este fue menor en aquellos pacientes con mutaciones detectadas en genes modificadores epigenéticos, mutaciones DAT y a mayor número de mutaciones. En cuanto a trombosis, se encontró asociación entre trombosis y la presencia de mutaciones DAT, TET2 y DNMT3A en la cohorte global. En NMP solo se encontró asociación de trombosis con la presencia de mutaciones en DNMT3A. Se encontraron 17 mutaciones no canónicas en JAK2, MPL y CALR. Se identificó y caracterizó una doble mutación en cis S505C y W515R en MPL observándose que la mutación S505C coopera con la mutación W515R aumentando la actividad transcripcional de STAT5 y la proliferación de células portadoras. Identificamos una familia con trombocitosis familiar y caracterizamos la mutación con actividad constitutiva JAK2 R683 como la causal del cuadro. En cuanto al haplotipo 46/1 se identificaron interacciones diferenciales mediante el estudio de la estructura de la cromatina. Dichas interacciones conllevan un cambio de expresión en JAK2, PD-L2 y, de manera más relevante, PD-L1 en linfocitos. Las conclusiones más relevantes de esta tesis son: 1) la secuenciación de genes implicados en patología mieloide tiene utilidad diagnóstica y pronóstica en pacientes con neoplasias mieloproliferativas. 2) Las dobles mutaciones de MPL son capaces de modificar la biología de la enfermedad mientras que a mutación germinal R683G de JAK2 ocasiona una trombocitosis familiar. 3) El estudio de la estructura tridimensional del genoma nos ha ayudado a identificar la sobreexpresión de PD-L1 como un posible mecanismo a través del cual el haplotipo 46/1 media su efecto.