Caracterización fenotípica y molecular de trueperella pyogenes; perfil de resistencia antimicrobiana y análisis proteómico

Resumen

1. introducción o motivación de la tesis Esta tesis doctoral incluye parte de los resultados obtenidos de los proyectos “Estrategias de Control frente a la Linfadenitis del Cerdo Ibérico en extensivo”, financiado por el Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (Rf. 20140020001824), y el Proyecto “Aproximaciones multiómicas al estudio de las resistencias a antibióticos en patógenos Gram-positivos”, dentro del XXII Programa Propio de Fomento de la Investigación, Modalidad 4.2. Ayudas para potenciar el establecimiento de SINERGIAS en el desarrollo de proyectos I+D precompetitivos. T. pyogenes es un microorganismo ubicuo, que se puede encontrar en la piel, orofaringe y las vías respiratorias superiores, mucosa urogenital y gastrointestinal de los animales sin producir manifestaciones clínicas. Se ha demostrado que es capaz de infectar a una gran variedad de animales domésticos, incluyendo perros y gatos, animales silvestres y se han descrito cuadros clínicos en personas en contacto con animales. Este patógeno oportunista causa una gran variedad de manifestaciones clínico-lesionales, fundamentalmente en rumiantes y cerdos, siendo raro en caballos o aves, como mamitis, metritis, artritis, linfadenitis, otitis, peritonitis, piodermitis, onfaloflebitis, endocarditis, osteomielitis, bronconeumonías e infecciones urinarias y genitales, aunque también producir infecciones sistémicas, en función de la edad, el estado inmune del animal, que puede verse alterado por la presencia de otras enfermedades inmunosupresoras y factores ambientales, que permiten la supervivencia de la bacteria. Esta enfermedad puede ser diagnosticada en el animal vivo o bien durante la inspección de las canales en el matadero, y originan el decomiso parcial o total, dando lugar a importantes pérdidas económicas para las explotaciones afectadas de rumiantes o cerdos. A pesar de su importancia clínica y su frecuencia de presentación, existe un desconocimiento sobre los mecanismos de acción patógena y a su papel como agente etiológico primario en las enfermedades asociadas a este agente. Por otra parte, la información que se dispone actualmente sobre el comportamiento de T. pyogenes frente a los antimicrobianos utilizados en ganadería es limitada, y hasta hace tres años, no existían normas publicadas para la realización de las pruebas de sensibilidad in vitro para esta especie, que permitieran comparar los resultados entre estudios. En el año 2017, la CLSI publicó un nuevo documento para estandarizar los métodos para la realización de las pruebas e interpretación de resultados con bacterias poco frecuentes y de difícil crecimiento, aisladas de animales (VET06, CLSI M45). El documento VET06 establece puntos de corte para la categoría susceptible para la penicilina, ampicilina, eritromicina y trimethoprim/sulfametoxazol, pero no para otros antimicrobianos de uso frecuente en ganadería. Por último, existen importantes lagunas en el control basado en la vacunación, ya que las vacunas que se han utilizado tradicionalmente han sido vacunas inactivadas, que se aplican para el control de los brotes causados en una explotación, pero no son eficaces para otros brotes. Por ello, el principal objetivo de este trabajo es aportar información relevante para el control de las enfermedades causadas por Trueperella pyogenes en ganado porcino y rumiantes, especies donde esta bacteria tiene mayor importancia sanitaria y económica. 2.contenido de la investigación Se han llevado a cabo diferentes estudios para cumplir los siguientes objetivos específicos Objetivo 1: Estudio de la sensibilidad antimicrobiana y diversidad genética de cepas de Trueperella pyogenes aisladas de ganado porcino. Estudio 1: “Antimicrobial susceptibility and genetic characterization of Trueperella pyogenes isolates from pigs reared under intensive and extensive farming practices” Este trabajo ha sido publicado en la revista Veterinary Microbiology, vol 232, pp: 89-95, https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2019.04.011 y se presenta como indicio de calidad para la lectura y defensa de la tesis doctoral (Con un factor de impacto según el Journal Citation Report (2017), de 2,524, situado en el primer decil (8/140) dentro de la categoría de Ciencias Veterinarias. En este trabajo se analizaron 180 aislamientos de T. pyogenes, obtenidos de cerdos sacrificados en matadero y criados bajo sistemas intensivos (TpIN, n = 89) y extensivos (TpEX, n = 91). Se utilizaron análisis de tipificación mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) para caracterizar genéticamente las cepas y análisis de concentración inhibitoria mínima (MIC) para determinar la distribución de MIC. Se obtuvieron valores bajos de MIC90 para penicilina y amoxicilina (0,008 y 0,06 µg / ml, respectivamente), ceftiofur, gentamicina y enrofloxacina (1 µg / ml, respectivamente), por lo que podrían aconsejarse para el tratamiento empírico de las infecciones por T. pyogenes. A excepción de la penicilina, la amoxicilina y el ceftiofur, se observó una diferencia estadísticamente significativa en la distribución MIC de todos los antimicrobianos analizados entre los aislados TpIN y TpEX. Además, los valores de MIC90 fueron más altos en TpIN que en los aislados de TpEX para neomicina y estreptomicina (32 µg / ml frente a 8 µg / ml), sulfametoxazol / trimetoprima (30,4 / 1,6 µg / ml frente a 1,90 / 0,10 µg / ml) y tilosina (≥ 1024 µg / ml frente a 1 µg / ml). En base a los resutlados de PFGE, se detectó una diversidad genética relativamente menor en TpIN en comparación con los aislados de TpEX (GD 0,42 y GD 0,47, respectivamente). Todos los aislamientos se distribuyeron en tres grupos genéticos (A, B, C). Los aislados de TpIN se asociaron estadísticamente con el grupo A (P = 0,0002; OR 3,21; CI95 1,74-5,93), mientras que los TpEX se distribuyeron en todo el dendrograma, mostrando una mayor diversidad genética. Estos datos sugieren que la susceptibilidad a los antimicrobianos y la variabilidad genética de los aislados de T. pyogenes podrían estar influidos por los sistemas de manejo. Objetivo 2: Estudiar la posible relación epidemiológica entre aislamientos de Trueperella pyogenes obtenidos de porcino y rumiantes. Se han llevado a cabo dos estudios Estudio 2: “Antimicrobial susceptibility of Trueperella pyogenes isolated from food-producing ruminants” Este trabajo ha sido enviado a Veterinary Microbiology en agosto de 2019, y está en revisión cuando se presenta la tesis. Se han analizado un total de 96 aislados de Trueperella pyogenes, obtenidos de bovinos (n = 34), ovinos (n = 35) y caprinos (n = 27), e identificados por PCR en tiempo real (qPCR), para determinar la susceptibilidad a 12 antimicrobianos de uso frecuente en ganadería, mediante el ensayo de microdilución en caldo. Nuestros resultados muestran que las distribuciones de concentración inhibitoria mínima (MIC) de apramicina, gentamicina, estreptomicina, oxitetraciclina, tilosina y eritromicina mostraron una tendencia a la bimodalidad, siendo unimodal para el resto de los antimicrobianos. Se obtuvieron valores bajos de MIC90 para penicilina, amoxicilina, ceftiofur, enrofloxacina y gentamicina (<1 μg / ml), por lo que podrían ser la primera línea de tratamiento empírico para el control de las enfermedades producidas por T. pyogenes en rumiantes. De acuerdo con los puntos de corte específicos de T. pyogenes para penicilina, sulfametoxazol/ trimetoprim y eritromicina, el 93,7% de los aislamientos fueron susceptibles a la penicilina y el 77,2% a eritromicina, mientras que el 92,7% no fueron susceptibles al sulfametoxazol/trimetoprim. Se observaron diferencias significativas en la distribución MIC de casi todos los antimicrobianos, excepto la enrofloxacina, la tilosina y la eritromicina frente a cepas aisladas de bovinos, ovinos o caprinos, aunque todos los antimicrobianos mostraron valores de MIC90 similares, excepto la apramicina y la oxitetraciclina que mostraron valores más altos para la inhibición de cepas de origen bovino. Estos datos muestran información interesante sobre los antimicrobianos de elección para el tratamiento de infecciones causadas por T. pyogenes en rumiantes. Estudio 3: “Perfil de sensibilidad antimicrobiana de Trueperella pyogenes: aportaciones para el control en animales de abasto”. Este trabajo ha sido presentado en el XXIV Simposio de AVEDILA (Asociación de Especialistas en Diagnóstico Laboratorial Veterinario) en forma de comunicación oral. Noviembre 2019, Pamplona, España. En este trabajo realizamos un análisis de todos los aislamientos, comparando los resultados obtenidos entre cerdos y rumiantes y cumpliendo, así, uno de los objetivos marcados en esta tesis doctoral. Se muestran los resultados de distribución de CMI, CMI50, CMI90 y porcentaje de cepas no sensibles a los antimicrobianos en estudio frente al total de aislamientos (n=276), y se comparan en función de la especie de origen de las cepas; ganado porcino (n=180) y rumiantes (n=96). Los antimicrobianos más eficaces frente al total de cepas (n=276) han sido penicilina y amoxicilina (CMI90 de 0.008 µg/ml). Hemos obtenido buenos resultados con ceftiofur, gentamicina y enrofloxacina (1 µg/ml). Por otra parte, detectamos valores de CMI90 elevados de tilosina (128 µg/ml), seguidos de los valores de neomicina, estreptomicina, oxitetraciclina y eritromicina, todos de 16 µg/ml De acuerdo con nuestros resultados, los antimicrobianos penicilina y amoxicilina pueden ser utilizados como primera línea de tratamiento para el control de las infecciones provocadas por T. pyogenes en animales de abasto. Este estudio resalta la importancia de realizar pruebas de sensibilidad in vitro para confirmar resultados y asegurar el éxito del tratamiento, además de para monitorizar los microorganismos, ya que se han detectado cepas no sensibles a la penicilina (3.6%) según los puntos de corte actualmente disponibles. Cuando se comparan los resultados de ambas poblaciones (aislamientos de porcino y aislamientos de rumiantes), se observan diferencias estadísticamente significativas (P<0.05) en la distribución de CMI de todos los antimicrobianos, excepto de penicilina y amoxicilina (Figura 1), y se puede apreciar que las cepas aisladas de ganado porcino requieren, en general, concentraciones de antimicrobiano más altas para inhibir su crecimiento que las cepas de rumiantes. Nuestro trabajo aporta información interesante para la determinación de puntos de corte específicos para T. pyogenes, inexistentes hasta la fecha para la mayoría de antimicrobianos e imprescindibles a la hora de un tratamiento eficaz y sostenible frente a este patógeno. Objetivo 3: Identificar y seleccionar las proteínas de superficie comunes de Trueperella pyogenes con el fin de desarrollar una vacuna eficaz frente a la infección producida por este microorganismo. Estudio 4: “Study of Trueperella pyogenes pan-surfome as source of putative vaccine candidates” Este trabajo está enviado a PLOS One, y está en revisión cuando se presenta la tesis. En este estudio se obtuvo el “pan-surfoma” de 16 aislamientos clínicos de T. pyogenes mediante digestión de superficie con tripsina con el objetivo de identificar algún antígeno nuevo para futuros estudios vacunales. Los aislamientos clínicos fueron “pelados” (digestión con tripsina de células vivas) y analizados mediante LC/MS/MS para identificar el “pan-surfoma”. Se identificaron un total de 1144 proteínas, 260 de las cuales resultaron ser de superficie (22,72%), 820 se incluyeron en la categoría de proteínas citoplasmáticas (71,68%) y, finalmente, no fue posible identificar la categoría subcelular (desconocida) de 64 proteínas (5.59%). Todas las proteínas de superficie se clasificaron en los tres grupos A, B y C (de mejor a peor) en función de su potencial para ser incluidas en futuros estudios de inmunización y vacunación. Únicamente se tuvieron en cuenta las proteínas de superficie, dado que son las más expuestas al sistema inmune. De las 260 proteínas de superficie, 47 fueron lipoproteínas (18.1%), 51 resultaron proteínas de anclaje a la pared (19,6%) y 149, proteínas de membrana (57,31%), aunque también se identificaron 13 proteínas secretadas (5%). Una vez debidamente identificadas, se clasificaron según los siguientes parámetros: ser expresadas de forma constante en la población (al menos en 2 de las 3 réplicas realizadas para cada aislamiento), ser altamente conservadas (gran homología con las cepas de T. pyogenes secuenciadas del NCBI) y estar ampliamente distribuidas en entre los aislamientos (% de los aislamientos en el que las proteínas están presentes). De este modo, las proteínas se clasificaron en tres grupos; el grupo A (n=14) incluye todas las proteínas presentes en más del 70% de los aislamientos, el grupo B (n=14) entre 50 y 70%, y el grupo C (n=17) entre 30% y 50%. Todas las proteínas del ranking mostraron una homología en su secuencia de aminoácidos de entre el 82.5% y el 100% con los aislamientos de T. pyogenes que han sido secuenciados por completo (n=10). Finalmente, todas estas proteínas se analizaron usando el algoritmo VaxiJen (http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html), que se basa en las propiedades fisicoquímicas de las proteínas para predecir la propiedad antigénica de las del ranking. Aquellas proteínas con una puntuación inferior a 0.5, se descartaron de la selección. En total, el grupo A quedó con 13 proteínas, el grupo B, con 10, y el grupo C, con 13. En conclusión, queda demostrada la utilidad de la técnica proteómica de digestión de células vivas (pelado), y del subsecuente análisis mediante espectrometría de masas, para la descripción del “pan-surfoma” de T. pyogenes. A pesar de la contaminación con proteínas citosólicas, debida a la lisis, se ha identificado un gran número de proteínas de superficie. Las 13 incluidas en el grupo A (4 proteínas de pared, 2 proteínas de membrana, 3 proteínas secretadas y 3 lipoproteínas) son atractivas para el desarrollo de vacunas recombinantes o de subunidades, aunque son recomendables más estudios en profundidad. 3.conclusión 1. Según nuestros resultados, los antimicrobianos penicilina (CMI90 = 0,008 µg/ml), amoxicilina (CMI90 = 0,06 µg/ml) y ceftiofur (CMI90 = 1 µg/ml) pueden ser utilizados como primera línea de tratamiento para el control de las infecciones producidas por Trueperella pyogenes en ganado porcino criado en sistemas intensivos y extensivos. 2. Se han detectado diferencias estadísticamente significativas en los perfiles de sensibilidad antimicrobiana y diversidad genética (PFGE) entre los aislamientos de T. pyogenes obtenidos de cerdos criados en sistemas extensivos e intensivos. Estos datos sugieren que las prácticas de manejo influyen en las características fenotípicas y moleculares de los aislamientos. 3. Analizando los resultados obtenidos con aislamientos obtenidos de rumiantes, se observaron algunas diferencias entre la distribución de CMI de los antimicrobianos entre bovino, ovino y caprino, aunque los valores de CMI90 de penicilina, amoxicilina y ceftiofur (≤1 µg/ml) permiten aconsejar su uso para el control de las infecciones por este patógenos en bovino, ovino y caprino. Por otra parte, no se aconseja la utilización de otros antimicrobianos, como la oxitetraciclina (32 µg/ml, tilosina (512 µg/ml) y eritromicina (≥1024 µg/ml). 4. De acuerdo con nuestros resultados, los antimicrobianos penicilina y amoxicilina pueden ser utilizados como primera línea de tratamiento para el control de las infecciones provocadas por T. pyogenes en animales de abasto, aunque debe confirmarse en el laboratorio su eficacia, ya que aplicando los puntos de corte publicados (penicilina, sulfametoxazol-trimetoprim, eritromicina), hemos detectado cepas no sensibles frente a los tres antimicrobianos. 5. Nuestro trabajo aporta información interesante para la determinación de puntos de corte específicos para T. pyogenes, inexistentes hasta la fecha para la mayoría de antimicrobianos e imprescindibles a la hora de un tratamiento eficaz y sostenible frente a este patógeno. 6. Se demuestra la utilidad de la técnica proteómica de digestión de células vivas (pelado) y posterior análisis mediante espectrometría de masas para la descripción del “pan-surfoma” de T. pyogenes, obteniendo un total de 260 proteínas superficiales, que pueden ser utilizadas con fines diagnósticos y de control de la enfermedad. 7. Del conjunto de proteínas superficiales identificadas, 13 (5 proteínas de pared celular, 3 lipoproteínas, 3 proteínas secretadas y 2 proteínas de membrana) están presentes en más del 70 por ciento de los aislamientos de ganado porcino analizados, y se proponen como posibles candidatos para la elaboración de vacunas de subunidades para el control de las enfermedades producidas por T. pyogenes. 4. bibliografía Alkasir R, Wang J, Gao J, Ali T, Zhang L, Szenci O, Bajcsy ÁC, Han B. 2016. Properties and antimicrobial susceptibility of Trueperella pyogenes isolated from bovine mastitis in China. Acta Vet Hung 64:1–12 http://dx.doi.org/10.1556/004.2016.001. 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