Estudio de la degeneración de las células ganglionares de la retina tras axotomía del nervio ópticoensayo de nuevas terapias celulares y farmacológicas

Resumen

La retina es una extensión del SNC y se tiene fácil acceso lo que la hace un modelo único del Sistema Nervioso en general. Las células ganglionares de la retina (CGR) son las que forman el nervio óptico (NO) y envían la información visual al cerebro. Las neuronas del SNC son incapaces de dividirse, por lo que no existe la posibilidad de que se formen nuevas neuronas y sustituyan a aquellas que están dañadas. La lesión del NO produce la degeneración de gran parte de la población de CGR en dos fases, una rápida en los primeros 14 días y una lenta, y que existe una respuesta en el ojo contralateral. En rata, se ha documentado que el patrón temporal de muerte de las CGR varía en función de la distancia a la que se seccione el NO con respecto al globo ocular. Las células de la microglía juegan un papel esencial en la respuesta inmunitaria innata y neuroinflamación en el SNC. Los factores neurotróficos son factores de crecimiento endógenos necesarios para la supervivencia de las neuronas. Los retinoides representan una familia de compuestos derivados de la vitamina A, que han demostrado desempeñar un papel tanto en la proliferación como en la diferenciación en la neurogénesis adulta. La minociclina es un antibiótico tetraciclínico que alivia la respuesta inflamatoria y proporciona neuroprotección. La terapia con células madre es una herramienta ideal para la reparación del SNC, ya que las células madre son capaces de autorregenerarse y de diferenciarse en otros tipos celulares, así como secretar diversos factores que promuevan la supervivencia de las neuronas. OBJETIVOS: Los objetivos generales de esta tesis son: i/caracterizar los cultivos organotípicos de retina como modelo de estudio de la población de las CGR; ii/ analizar el comportamiento de la curva de muerte de las CGR tras una lesión en dos distancias diferentes, tanto en el ojo lesionados como contralaterales; iii/ estudiar la supervivencia de las células estromales derivadas del tejido adiposo tras inyección intravítrea, y el papel que tienen en el curso de muerte de las CGR tras axotomía; iv/ estudiar el comportamiento de las células del cuerpo ciliar (CC), sus neuroesferas (NS-CC), las neuroesferas de células de la zona subventricular (NS-ZSV) y las células embrionarias ESR1, tras su inyección en el vítreo en retinas axotomizadas y deplecionadas v/ analizar el papel que tienen las proteínas del inflamasoma NLRP3 en las CGR; vi/ analizar el papel del antagonismo del TNFR1 en la supervivencia de las CGR en retinas axotomizadas; vii/ estudios neuroprotectores preliminares del agonismo de los receptores de ácido retinoico y el estudio a largo plazo de BDNF. MATERIAL Y MÉTODOS: Para la realización de los experimentos se utilizaron: ratones macho pigmentados (C57BL/6) con un peso que entre 25-35g, ratones machos pigmentados transgénicos con expresión de la proteína verde fluorescente bajo el promotor de la actina, ratones KO de la proteína NLRP3, ratones KO de la proteína ASC y ratones KO de la proteína Caspasa 1/11, con edades comprendidas entre las 8 y 12 semanas de edad. El número de retinas analizadas por grupo/estirpe/intervalo de tiempo varía entre los distintos estudios de 4 a 20. Se realizó un modelo de daño axonal de las CGR: el aplastamiento del NO (ApNO). El ApNO se realizó a 0,5 mm o a 2 mm del globo ocular. Los tiempos de análisis tras la axotomía variaron de 3 días a 4 meses. El suministro de los fármacos o células se hizo mediante inyección intravítrea o intraperitoneal. El análisis anatómico de las retinas se realizó principalmente en retinas completas diseccionadas a plano inmunodetectadas con anticuerpos anti-Brn3a o Rbpms (CGR), anti-Iba-1 (microglía), anti-GFAP (astrocitos), anti-NeuN (neuronas) y anti-GFP. Algunas retinas se diseccionaron en fresco para analizar el nivel de ARNm mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o para realizar cultivos organotípicos de retina (COR). El fotografiado de las muestras se llevó a cabo con un microscopio de epifluorescencia y un microscopio confocal. Los fotomontajes de retinas se reconstruyeron a partir de 154 imágenes individuales (11x14) capturadas con el objetivo de 20x. Las CGR-Brn3a+ se cuantificaron y se estudiaron los mapas topográficos mediante rutinas automáticas. RESULTADOS Y CONCLUSIONES. Objetivo 1: En los COR existe una pérdida en las primeras 24 horas de aproximadamente un 60% de las CGR, seguida de una fase gradual de pérdida hasta los 21 días de cultivo. Este curso se asemeja al patrón de muerte observado in vivo, pero 2-3 veces más rápido. La retina en los COR sufre una degeneración en todas sus capas conforme más tiempo pase en el cultivo. Objetivo 2: Aunque el curso de pérdida de las CGR en retinas lesionadas no difiere según la distancia a la que se practica el ApNO, en las retinas contralaterales existe una pérdida significativa de un 15% que se produce antes cuando la axotomía se realiza más cerca del ojo contralateral. El tratamiento sistémico con minociclina o meloxicam, rescata las CGR en las retinas contralaterales pero no en las retinas lesionadas. Objetivo 3: Las células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo (Ad-CEM) se observan in vivo en el vítreo mediante la OCT hasta 21 días tras el trasplante intravítreo. Ex vivo, las Ad-CEM se encuentran formando una membrana sobre la retina, tanto en retinas intactas como lesionadas. La inyección intravítrea de Ad-CEM no producía toxicidada a las CGR, al menos hasta 21 días tras el trasplante. Los cursos de muerte de las CGR tras ApNO no diferían entre el grupo control y el grupo tratado. Objetivo 4: Tanto las células del CC, como las NS-CC y NS-ZSV sobreviven en la retina formando una membrana epirretiniana sin producir toxicidad en la población de las CGR y provocando un aumento de la supervivencia tras axotomía del NO, con especial atención a las NS-CC que alcanzan un alto porcentaje de supervivencia. Las células del CC y las NS-CC penetran en la capa de células ganglionares de retinas deplecionadas y consiguen diferenciarse en células Brn3a+ y Neun+, mientras que las NS-ZSV tienen menos capacidad diferenciadora pero consiguen penetrar hasta la capa nuclear interna. Objetivo 5: El déficit de las proteínas que conforman el inflamasoma NLRP3 no provoca ningún cambio en el número total de las CGR cuantificadas comparadas con las retinas silvestres. En las retinas ASC-/- y NLRP3-/- no se observa ninguna diferencia en el curso de muerte de las CGR tras ApNO comparado con las retinas silvestres. El grupo Casp1/11-/- existe una supervivencia de hasta un 50% de las CGR comparado con retinas silvestres a 9 y 21 días tras lesión. Objetivo 6: Tras ApNO, hay un aumento de la expresión génica de TNFR1 y TNFalfa. El tratamiento, tanto sistémico como directo, con el antagonista del TNFR1 (R7050) aumenta la supervivencia de las CGR tras axotomía. El BDNF y el tratamiento combinatorio (R7050 y BDNF) producen un gran efecto neuroprotector en las CGR tras axotomía, tanto a 5 como a 14 días tras ApNO. Objetivo 7: El tratamiento con agonistas de RARalfa y de RARbeta promueve la supervivencia de las CGR tras ApNO, con inyecciones intravítreas o intraperitoneales diarias. Una inyección intravítrea de BDNF tras ApNO neuroprotege parte de las CGR hasta 45 días post-lesión.