Estudio del papel de las exoproteasas apra y lasb en las infecciones por pseudomonas aeruginosa

Abstract

Introducción: Pseudomonas aeruginosa es uno de los microorganismos Gram negativos que más frecuentemente causa bacteriemias nosocomiales. Por otro lado, también produce infecciones respiratorias crónicas, siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en pacientes con fibrosis quística. El sistema del complemento juega un papel importante en la respuesta inflamatoria y es clave para combatir las infecciones por este patógeno, por lo que no es extraño que P. aeruginosa haya desarrollado mecanismos que permiten eludirlo, como la producción de proteasas que degradan directamente sus componentes. P. aeruginosa produce dos exoproteases principales, la elastasa LasB y la proteasa alcalina AprA. La capacidad de estas exoproteasas para degradar algunas proteínas del sistema del complemento ha sido demostrada in vitro utilizando componentes purificados. Sin embargo, su papel en las infecciones causadas por P. aeruginosa es poco conocido. Por este motivo, el objetivo general de esta tesis doctoral fue estudiar el papel de las exoproteasas AprA y LasB en las infecciones por Pseudomonas aeruginosa. Contenido de la investigación: En una primera parte del trabajo, se estudio la contribución de AprA y LasB en la patogénesis de las infecciones del torrente sanguíneo causadas por P. aeruginosa. Para ello, se utilizó un set de mutantes isogénicos deficientes en AprA, LasB o ambas proteasas. Nuestros resultados demostraron que éstas son las dos únicas exoproteasas de P. aeruginosa capaces de degradar el componente C3 del complemento, tanto en forma soluble como unido a la superficie bacteriana. Sin embargo, en los primeros instantes de la interacción complemento-bacteria, el déficit de estas proteasas no tuvo ningún efecto sobre la opsonización por C3 de la bacteria, ni sobre su capacidad para evadir la muerte por opsonofagocitosis. Por otra parte, los experimentos in vivo utilizando modelos murinos de infección sistémica revelaron que la perdida de AprA y LasB no atenúa la la virulencia del microorganismo. Finalmente, tampoco encontramos ninguna asociación entre la capacidad de degradar C3 y la habilidad de desarrollar una infección letal en una colección de 188 aislados clínicos procedentes de bacteriemias. En la segunda parte, investigamos la contribución de AprA y LasB en la intensa inflamación pulmonar característica de los pacientes con fibrosis quística. Mediante el análisis de un conjunto de aislados obtenidos de infecciones pulmonares agudas y crónicas demostramos que los aislados de infecciones crónicas inducen la producción de elevados niveles de C5a que se van acumulando debido a la pérdida de las exoproteasas AprA y LasB responsables de la escisión de C5a. Además, observamos que la incapacidad de degradar C5a exhibida por los aislados procedentes de pacientes con fibrosis quística se debe a mutaciones en la proteína reguladora LasR. De esta forma, la complementación de un aislado incapaz de degradar C5a con un la proteína LasR funcional restauró su capacidad de degradar C5a presente en el fluido broncoalveolar humano. Conclusiones: Las proteasas AprA y LasB, confieren a P. aeruginosa la capacidad para degradar C3, pero no contribuyen a la virulencia en un modelo murino de infección sistémica por P. aeruginosa y no son buenos marcadores para el pronóstico de la mortalidad en las infecciones del torrente sanguíneo causadas por este microorganismo. Por otra parte, en las infecciones respiratorias crónicas, la pérdida de la capacidad de degradar C5a es debida a mutaciones en el regulador LasR. Este fenotipo, adquirido en el proceso de adaptación de P. aeruginosa al pulmón con fibrosis quística, puede ser el responsable de la acumulación de C5a y de la disfunción generalizada de los neutrófilos que predispone al aumento de la inflamación y la reducción en la capacidad para eliminar las bacterias descrito en pacientes con fibrosis quística.