Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) and myeloid G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) are novel mediators of vascular dysfunction induced by hypertension and obesity

Resumen

La hipertensión y la obesidad son importantes problemas de salud en todo el mundo con notables consecuencias sobre la morbilidad y la mortalidad. De hecho, tanto la hipertensión como la obesidad son importantes factores de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares. La disfunción endotelial, el remodelado vascular y las alteraciones en la mecánica vascular son aspectos comunes del daño vascular en hipertensión y obesidad. Durante las últimas décadas, se ha demostrado la importancia de la inflamación de bajo grado en el daño vascular asociado a las enfermedades cardiovasculares. Dicha inflamación se caracteriza por la acumulación de células inflamatorias en la vasculatura y en otros tejidos como el tejido adiposo perivascular (PVAT, del inglés perivascular adipose tissue) así como con el aumento de citoquinas proinflamatorias locales y circulantes. Por tanto, la identificación de nuevos mediadores inflamatorios implicados en dicho daño se ha convertido en un área de investigación muy importante. Estudios previos identificaron el interferón-γ (IFNγ) o el factor de necrosis tumoral-α (TNFα) como importantes citoquinas implicadas en el daño vascular asociado a la hipertensión. Además, se acepta que TNFα es un mediador clave implicado en la resistencia a la insulina y el daño vascular observados en obesidad. En el primer capítulo de esta Tesis Doctoral se estudia la implicación del gen 15 estimulado por interferón (ISG15), una proteína similar a la ubiquitina que induce una modificación postraduccional reversible (ISGilación) y que también puede secretarse como forma libre, en el desarrollo de daño vascular asociado a la hipertensión. Por otro lado, estudios anteriores demostraron que la quinasa de receptores acoplados a proteínas G (GRK2), una serina/treonina quinasa que desensibiliza múltiples receptores acoplados a proteína G, juega un papel importante en el control de la adiposidad, la sensibilidad a la insulina, y las alteraciones vasculares asociadas a la hipertensión y la obesidad. Sin embargo, se desconocía el papel de GRK2 procedente de células inflamatorias en el daño vascular asociado a la obesidad. El segundo capítulo de esta Tesis Doctoral explora la contribución de GRK2 presente en células mieloides en las alteraciones vasculares asociadas a la obesidad. Para ello, se han utilizado enfoques multidisciplinares en sistemas celulares, modelos de hipertensión y obesidad en ratones transgénicos, así como muestras de pacientes, y se han explorado cambios en la función, la estructura y las propiedades mecánicas vasculares, así como los mecanismos moleculares subyacentes. Los principales resultados fueron los siguientes: 1. Un análisis bioinformático identificó a ISG15 como un mediador del daño vascular asociado a la hipertensión. La expresión de ISG15 en células mononucleares de sangre periférica humana correlacionó positivamente con la presión arterial sistólica y el grosor íntima-media carotídeo. De acuerdo con estos datos, la expresión de Isg15 incrementó en la aorta de modelos animales de hipertensión y en células vasculares tratadas con angiotensina II (Ang II). Los ratones ISG15-/- mostraron protección frente a la hipertensión inducida por Ang II. Además, estudios proteómicos revelaron una expresión diferente de proteínas implicadas en la función y remodelado cardiovascular, así como de proteínas implicadas en el estado redox vascular, en la aorta de ratones ISG15-/- infundidos con Ang II. De hecho, los ratones ISG15-/- estaban protegidos de la rigidez vascular inducida por Ang II, el remodelado de la elastina, la disfunción endotelial y la expresión de marcadores de inflamación y de estrés oxidativo. Por el contrario, ratones con excesiva ISGilación (USP18C61A) mostraron un aumento en la hipertensión inducida por Ang II, inflamación y generación de especies reactivas de oxígeno (ROS, del inglés reactive oxygen species), junto con alteraciones en la elastina y dilatación y rotura de la aorta. De acuerdo con estos resultados, se observó un aumento en la expresión de ISG15 en aneurismas aórticos abdominales humanos y murinos. En cuanto a los mecanismos, nuestros resultados demuestran que ISG15 induce la producción vascular de ROS y que el tratamiento antioxidante previene la disfunción endotelial y el remodelado vascular inducidos por ISG15. 2. Los niveles de GRK2 mostraron una correlación positiva con marcadores mieloides (CD68) y linfoides (CD3, CD4 y CD8) y con leptina, en el PVAT de pacientes con aneurisma aórtico abdominal. Además, utilizando un modelo de ratón con deleción específica de GRK2 en células mieloides (LysM-GRK2+/-), demostramos que la disminución de los niveles de GRK2 en las células mieloides previene el deterioro de las relajaciones dependientes de endotelio a acetilcolina e insulina inducido por el PVAT en animales alimentados con una dieta rica en grasa. Además, la disminución de GRK2 en células mieloides atenuó el incremento de la citoquina proinflamatoria TNFα, la expresión de la subunidad 1 de la NADPH oxidasa (NOX) 1 y la infiltración de macrófagos y linfocitos T en PVAT, inducidos por la dieta alta en grasa. Finalmente, el bloqueo farmacológico de las vías de TNFα o NOX1 restauró las respuestas vasodilatadoras a insulina en las arterias con PVAT de animales alimentados con dieta alta en grasa. Como conclusión, nuestros resultados sugieren que ISG15 y GRK2 mieloide son nuevos mediadores del daño vascular en la hipertensión y la obesidad a través del estrés oxidativo y la inflamación. Hypertension and obesity are significant health problems worldwide with remarkable consequences on morbidity and mortality. In fact, both hypertension and obesity are major risk factors for cardiovascular diseases (CVD). Endothelial dysfunction, vascular remodelling and altered vascular mechanics are common features of vascular damage in hypertension and obesity. During the last decades, it became evident the importance of low-grade inflammation in the vascular alterations associated with these diseases. This inflammatory status is characterized by accumulation of inflammatory cells in the vasculature and other tissues such as the perivascular adipose tissue (PVAT), and enhanced local and circulating pro-inflammatory cytokines. Therefore, the identification of novel inflammatory mediators involved in the vascular damage associated with hypertension and obesity has become an area of active research. Earlier studies identified interferon-γ (IFNγ) and tumor necrosis factor-α (TNFα) as important cytokines involved in vascular damage in hypertension. Moreover, TNFα has been recognized a key mediator involved in insulin resistance and vascular damage in obesity. In the first chapter of this PhD Thesis we studied the implication of interferon-stimulated gene 15 (ISG15), an ubiquitin-like protein that induces a reversible post-translational modification (ISGylation) and can also be secreted as a free form, in the development of vascular damage associated with hypertension. On the other hand, previous evidence found a role for G-receptor kinase 2 (GRK2), a serine/threonine kinase that desensitizes multiple G protein-coupled receptors, in adiposity insulin sensitivity and in the vascular alterations associated with hypertension and obesity. However, whether GRK2 expressed in a specific subset of inflammatory cells might have a role in the vascular damage associated with obesity, is unknown. The second chapter of this PhD Thesis explores the contribution of myeloid GRK2 to the vascular alterations associated with obesity. For this, we used multidisciplinary approaches in cell-based systems, animal models of hypertension and obesity in transgenic mice and samples from patients, to explore changes in vascular function, structure and mechanical properties, as well as underlying molecular mechanisms. The main results were as follows: 1. Bioinformatic analysis identified ISG15 as a mediator of hypertension-associated vascular damage. ISG15 expression in human peripheral blood mononuclear cells positively correlated with systolic blood pressure and carotid intima-media thickness. Consistently, Isg15 expression was enhanced in aorta from hypertension models and in angiotensin II (Ang II)-treated vascular cells. ISG15-/- mice were protected against Ang II-induced hypertension. Proteomics revealed differential expression of proteins implicated in cardiovascular function and remodelling, and vascular redox state in aorta from Ang II-infused ISG15-/- mice. In fact, ISG15-/- mice were protected against Ang II-induced vascular stiffness, elastin remodelling, endothelial dysfunction and expression of inflammatory and oxidative stress markers. Conversely, mice with excessive ISGylation (USP18C61A) showed enhanced Ang II-induced hypertension, inflammation and reactive oxygen species (ROS) generation along with elastin breaks, aortic dilation and rupture. Accordingly, human and murine abdominal aortic aneurysms showed augmented ISG15 expression. Mechanistically, ISG15 induces vascular ROS production, while antioxidant treatment prevented ISG15-induced endothelial dysfunction and vascular remodelling. 2. GRK2 levels showed a positive correlation with myeloid- (CD68) and lymphoid-specific (CD3, CD4, and CD8) markers and with leptin in PVAT from patients with abdominal aortic aneurysms. In addition, using a mouse model of myeloid-specific GRK2 deletion (LysM-GRK2+/-), we showed that decreasing GRK2 levels in myeloid cells prevents the PVAT-induced impairment of endothelium dependent relaxations to acetylcholine and insulin in animals fed a high fat diet (HFD). Moreover, downregulation of GRK2 in myeloid cells attenuated HFD-mediated upregulation of pro-inflammatory cytokines such as TNFα, the expression of the NADPH oxidase (NOX)1 subunit and infiltration of macrophages and T lymphocytes in PVAT. Pharmacological blockade of TNFα or NOX1 pathways restored the impaired vasodilator responses to insulin in arteries with PVAT from HFD-fed animals. In conclusion our results suggest that ISG15 and myeloid GRK2 are novel mediators of vascular damage in hypertension and obesity through oxidative stress and inflammation.