New strategies for the design and development of protein antimicrobials based on phage products

Resumen

La resistencia a antibióticos es uno de los problemas de salud mundial más urgentes, lo cual hace de la búsqueda de nuevos antimicrobianos una prioridad. Por ello, la investigación en terapia fágica está experimentando un renacimiento como alternativa o complemento a los antibióticos. En particular, las (endo)lisinas son las proteínas codificadas por los fagos que son responsables de la lisis bacteriana debido a su actividad enzimática de hidrólisis del peptidoglicano. Estas lisinas se están empleando exógenamente contra bacterias, funcionando como antimicrobianos líticos y, por ello, también se denominan "enzibióticos". Los enzibióticos son altamente eficaces contra bacterias Gram-positivas. Sin embargo, se han considerado menos efectivos contra las Gram-negativas (G¿) debido a la presencia de la membrana externa. No obstante, no solo se han diseñado nuevas lisinas activas contra G¿ "desde fuera" sino que, además, existen ejemplos de lisinas que son intrínsecamente activas contra dichas bacterias. Tal actividad se ha relacionado con regiones similares a péptidos antimicrobianos (AMPs) presentes en las propias lisinas. Sin embargo, aún se desconoce la importancia evolutiva de esas regiones. En esta tesis se ha llevado a cabo una estrategia completa de diseño y desarrollo de antimicrobianos basados en lisinas fágicas, especialmente dirigidos contra patógenos G¿. En primer lugar, se compiló una base de datos de secuencias de lisinas para analizar características relacionadas con la arquitectura de los hospedadores bacterianos. Se observó la presencia de subdominios similares a AMPs dentro de una subpoblación relevante de lisinas de fagos de G¿ y se estableció un método de cribado bioinformático de este conjunto de datos para predecir dichos subdominios. Así se obtuvieron candidatos a enzibióticos con potencial de desestructurar la membrana externa. Uno de los candidatos, denominado Pae87, fue seleccionado para investigar su actividad intrínseca contra patógenos G¿, particularmente Pseudomonas aeruginosa, y para servir como base para el desarrollo de otras moléculas antimicrobianas. Se obtuvo un modelo tridimensional de Pae87 con un fragmento de peptidoglicano unido, identificándose así un posible subdominio de unión a sustrato. Además, se demostró la capacidad de Pae87 para unirse y permeabilizar la membrana externa, y esta actividad se relacionó con una región C-terminal específica denominada péptido P87. Este péptido mostró actividad antimicrobiana propia, comparable a la de la proteína completa, y se potenció mediante mutaciones racionales obteniendo el péptido derivado P88, con mayor eficacia bactericida, pero sin un aumento importante en su efecto citotóxico. La actividad de Pae87 también se mejoró fusionándola con un dominio de unión a calcio, dando lugar a la quimera Pae87F. Finalmente, dado que la vida media in vivo de las lisinas es relativamente corta, uno de los enfoques actuales para la administración de enzibióticos es su encapsulación y liberación controlada. Basándonos en la estructura superficial de Streptococcus pneumoniae, que destaca por la presencia de colina que sirve de anclaje para proteínas de superficie, se diseñó un polímero a base de quitosano. Dicho polímero se derivatizó con dietilaminoetanol (DEAE) que actúa como un análogo estructural y funcional de la colina. Por ello, las nanopartículas preparadas con quitosano-DEAE (ChiDE) resultaron ser capaces de unir específicamente proteínas de unión a colina. Así, las nanopartículas de ChiDE provocaron el encadenamiento de células de neumococo debido a la inhibición competitiva de las proteínas de unión a colina responsables de la separación de las células hijas. Las nanopartículas de ChiDE también fueron capaces de unir enzibióticos de unión a colina y liberarlos de forma controlada, aunque con cierto efecto citotóxico sobre células eucariotas