GAP43A new cannabinoid CB1 receptor-interacting protein

Résumé

La planta del cáñamo se ha utilizado en medicina desde hace al menos cincuenta siglos. Dos receptores de cannabinoides han sido bien caracterizados: el de tipo 1 (CB1R), que es especialmente abundante en las áreas del sistema nervioso central y el de tipo 2 (CB2R), que se expresa preferentemente en el sistema inmune. Niveles de expresión de CB1R particularmente altos se pueden encontrar en la formación hipocampal, que alberga circuitos implicados en la consolidación de la memoria. El giro dentado (DG) es la primera estación de procesamiento de la información. Los dos tipos celulares glutamatérgicos más importantes del DG son las células granulares (GCs) y las mossy cells MCs, implicadas en consolidacion de memoria y en epilepsia. CB1R esta localizado principalmente en los terminales presinápticos, donde regula la liberacion de neurotransmisores. De esta manera, CB1R media formas de plasticidad a corto y largo plazo en sinapsis inhibitorias y excitatorias. El mecanismo de acción canónico de CB1R implica el acoplamiento a proteinas G heterotriméricas, principalmente al subtipo Gi/o. Sin embargo, existen diferencias llamativas en las cascadas de señalizacion desencadenadas por CB1R en función del tipo celular, el ambiente celular u otros factores dependientes del contexto que se desconocen. Concretamente, diversos estudios han mostrado interacciones con proteínas intracelulares como posibles moduladoras de la acción del receptor. Sin embargo, estos estudios no han desvelado ninguna implicación patofisiológica de estas interacciones. Por tanto, la evaluación de la relevancia fisiológica y del potencial terapéutico de las distintas poblaciones del CB1R se ve impedida por la falta de conocimiento de la posibles interactores en un contexto celular específico. Con estos antecedentes nos propusimos caracterizar nuevos interactores de CB1R. Mediante un análisis inicial de detección por proteómica se seleccionó GAP43 como posible candidato, una proteína presináptica asociada al citoesqueleto. Su actividad depende mayoritariamente de la fosforilacion por PKC. Es un factor clave en el crecimiento y guía axonal durante el desarrollo. En el cerebro adulto modula procesos de tráfico de vesículas, plasticidad y aprendizaje. En la presente Tesis Doctoral se han establecido dos objetivos: 1) Identificar y validar GAP43 como nuevo interactor de CB1R y caracterizar sus consecuencias sobre la señalización del receptor in vitro. 2) Localizar los posibles complejos CB1R-GAP43 en el cerebro de ratón, con especial atención a distintas poblaciones neuronales, y estudiar sus posibles consecuencias funcionales. Para abordar el Objetivo 1, utilizamos la línea celular HEK293T, expresando CB1R y GAP43 (nativa o la versión activa o inactiva). Así, observamos por tres técnicas distintas que CB1R interacciona con GAP43 principalmente en su forma activa y ejerce un bloqueo parcial en el acoplamiento a proteinas G y la señalizacion mediada por el receptor, especificamente sobre la via de ROCK desencadenada, mientras que las rutas de AMPc y ERK, canonicamente dirigidas por acoplamiento a G¿i/o, no se vieron afectadas. Con respecto al Objetivo 2, detectamos complejos GAP43-CB1R en tejido de cerebro de ratón, selectivamente en las terminales glutamatérgias de las MCs. Dos aproximaciones complementarias, como son la inhibición farmacológica de la activación de GAP43 por PKC y la inoculación de virus recombinantes adenoasociados que expresan la forma activa o inactiva de GAP43 en MCs, nos permitieron determinar que la forma activa disminuye la funcionalidad de CB1R en las MC. Por último, generamos ratones knockout condicionales de GAP43 específicas en neuronas glutamatérgicas o GABAergicas. El estudio de conductas dependientes de hipocampo y de epilepsia en estos ratones mostraron que la deleción de GAP43 en neuronas glutamatérgicas conlleva pérdida de memoria y modula la actividad antiepiléptica de CB1R, en la cual las MCs desempeñan un papel fundamental