Human CD247 deficiency

Resumen

El T-cell receptor (TCR) es el receptor de antígenos de los linfocitos T. En humanos está compuesto por un heterodímero de cadenas variables (alfa/beta o gamma/delta), dos heterodímeros invariantes (CD3epsilon/gamma y CD3epsilon/delta) y un homodímero invariante (CD247, también llamado TCRzeta/zeta). El TCR desempeña un papel esencial en los linfocitos T durante su selección tímica y activación, por lo que mutaciones en los genes que codifican las cadenas del TCR se asocian a un tipo de inmunodeficiencia (IDTCR), que varía en gravedad dependiendo de la cadena afectada. Los casos de IDTCR son extremadamente raros pero son valiosos modelos para comprender la biología del TCR humano, ya que los modelos múridos o líneas tumorales humanas genéticamente modificadas no lo recapitulan fielmente. Nuestros objetivos fueron a) caracterizar el fenotipo de los linfocitos T en un nuevo caso de deficiencia de CD247 y establecer las características patognomónicas de la enfermedad, y b) estudiar cómo las mutaciones en homocigosis o heterocigosis en el gen CD247 pueden afectar al ensamblaje y tráfico del TCR desde el retículo endoplásmico (RE) hasta la superficie celular, así como su reciclaje y degradación. Para ello, estudiamos a) linfocitos T aislados de muestras de sangre venosa del paciente y su familia y b) líneas celulares de linfocitos T derivadas de éstos (para c y d), utilizando las siguientes técnicas: citometría de flujo, Western blot, inmunoprecipitación, microscopía confocal, cultivos in vitro de linfocitos T y ensayos funcionales. Los resultados en linfocitos T primarios indicaron que la nueva mutación en el gen CD247 (c.2T-C) codificaba una proteína truncada que resultó indetectable y provocaba una dramática disminución en los niveles de superficie y de señalización del TCR. Sin embargo, un pequeño porcentaje de células T recuperaba el nivel de expresión y señalización del TCR de los portadores debido a dos mutaciones somáticas, una mutación en un segundo sitio del gen y una en el sitio original o reversión. Establecimos un procedimiento rápido y sencillo de citometría intracelular para diagnosticar IDTCR en muestras de sangre venosa. Las líneas de linfocitos T generadas recapitulaban el fenotipo de la deficiencia parcial (+/¿) o completa (¿/¿) de CD247 en linfocitos ¿ß primarios. Los experimentos de inmunoprecipitación demostraron que los heterodímeros CD3 epsilon-gamma y épsilon-delta se unían al TCRalfa-beta in las células +/+ y +/¿, pero sólo a TCRalfa en las -/-, debilitando la existencia propuesta de un TCR hexamérico antes de su unión a CD247. Como era de esperar, el TCR sin CD247 sí señalizaba para su internalización pero sin embargo, no podía reciclarse, lo que apoya un papel central de CD247 en el reciclaje del TCR, pero no en su internalización. Los resultados de microscopía confocal demostraron que cuando CD247 estaba ausente, las cadenas CD3 se acumulaban en el RE y no en el Golgi, indicando que CD247 se incorpora al TCR en el RE en linfocitos T normales, lo que se confirmó en células +/+ y +/¿. Los ensayos de inhibición demostraron que los niveles de TCR en membrana aumentaron en las líneas CD247-deficientes y -suficientes tras bloquear el proteasoma, pero no el lisosoma. En conclusión, la existencia de linfopenia leve y mosaicismo somático funcional no deben distraernos de que la deficiencia de CD247 es una patología muy grave que requiere trasplante urgente de progenitores hematopoyéticos, pero que es fácil de diagnosticar mediante citometría intracelular o por el fenotipo TCR de membrana en portadores obligados. Las líneas celulares de linfocitos T deficientes de CD247 recapitulan el fenotipo de los linfocitos T primarios y ayudan a entender la dinámica de ensamblaje y degradación del TCR humano.