Adhesión de membranas lipídicas mediadas por la proteína mitofusina 1implicaciones en el proceso de fusión mitocondrial

Resumen

Las mitofusinas (Mfns) son proteínas transmembrana que residen en la membrana externa mitocondrial y una de sus características son su dominio GTPasa N-terminal, los dominios transmembrana que atraviesan por la bicapa lipídica dos veces y los dominios o regiones (Cc1 y Cc2) capaces de formar helicoides enrollados (Coiled-coil) similares a las formadas por las proteínas SNARE y proteínas virales. La deleción en uno de los genes MFN1 o MFN2 o la presencia de mutaciones de cualquiera de sus dominios funcionales y estructurales perjudican la fusión mitocondrial, las cuales inhabilitan el buen funcionamiento de un tejido u órgano en el cuerpo humano. No obstante, el modo de acción exacto de las Mfns sigue sin entenderse por completo. En esta tesis proponemos la expresión heteróloga, purificación de Mfn1 y su reconstitución en modelos de membranas para responder a las siguientes preguntas fundamentales: ¿Cuáles son las interacciones moleculares entre Mfns (Mfn1/Mfn1) ?, ¿Cuál es el papel de la función GTPásica de Mfns (Mfn1/Mfn1) ?, ¿Cuáles son los requisitos mínimos para la fusión de membrana? y ¿Es la interacción Mfn1-Mfn1 suficiente para promover la fusión de membranas? En nuestro caso el sistema modelo lipídico empleados son las vesículas unilamelares gigantes (GUVs), que se obtienen mediante la técnica de electroformación. Para la incorporación de Mfn1 a GUVs, se incluyó la formulación lipídica de las vesículas, el lípido funcionalizado DOGS- NTA en la cabeza polar para promover la unión específica de los grupos histidina de la proteína recombinante. La unión de la proteína al lípido DOGS-NTA se produjo mediante los grupos histidina de la proteína. Mediante microscopía de fluorescencia confocal, se pudo comprobar la unión específica de Mfn1 a la membrana lipídica a través de anticuerpos específicos fluorescentes. Se pudo observar que la interacción era reversible mediante la incubación del sistema con imidazol. Las membranas miméticas con Mfn1 fueron utilizadas como plataforma para visualizar procesos de adhesión cuando se incubaron con GTP. En presencia de GDP se logró observar el proceso de adhesión entre vesículas GUVs con Mfn1. Las energías de adhesión mediada por Mfn1 que obtuvimos fueron energía de adhesión (Eadh) = (2.7± 0.7) 108 J/m2 en presencia de GTP y Eadh = (2.7 ± 0.5) 108 J/m2 en presencia de GDP. Debido a la naturaleza flexible de las membranas lipídicas, se pudo observar cómo la fuerza de adhesión depende de la concentración superficial de Mfn1, controlada mediante la concentración del DOGS-NTA en la composición lipídica de las GUVs. La dependencia de la Eadh en función de la concentración superficial de Mfn1 es compatible con un mecanismo de unión cooperativo. Además, se comprobó que la incubación con GDP¿AlF4¿, nucleótido análogo de GTP no hidrolizable, no induce la adhesión de membranas lipídicas mediada por Mfn1. Este sistema biomimético ha permitido mostrar que: la proteína Mfn1 promueve la adhesión de vesículas lipídicas adyacentes, las fuerzas de adhesión están sostenidas molecularmente por el estado GDP de la proteína Mfn1, la energía de adhesión es del orden de 108 J/m2 y la adhesión de membranas mediada por Mfn1 es cooperativa. [1] Z. Wang and M. Wu. Phylogenomic reconstruction indicates mitochondrial ancestor was an energy parasite. Plos One, 9(10):11, 2014. [2] L. Ernster and G. Schatz. Mitochondria: a historical review. The Journal of Cell Biology, 91(3):227¿255, 1981. [3] John O. Holloszy. Regulation of mitochondrial biogenesis and glut4 expression by exercise. Comprehensive Physiology, 2011. [4] Michael T. Ryan and Nicholas J. Hoogenraad. Mitochondrial-nuclear commu- nications. Annual Review of Biochemistry, 76(1):701¿722, 2007. [5] Nahuel Zamponi, Emiliano Zamponi, Sergio A. Cannas, Orlando V. Billoni, Pablo R. Helguera, and Dante R. Chialvo. Mitochondrial network complexity emerges from fission/fusion dynamics. Scientific Reports, 8(1):363, 2018.