Mechano-chemistry and dynamics of biological and synthetic systems

Resumen

La tesis está enfocada en caracterizar las bases moleculares y mecano-químicas del funcionamiento de motores moleculares biológicos y artificiales. Por una parte, de las proteínas implicadas en la replicación del genoma mitocondrial humano, y por otra, de un interruptor molecular artificial (rotaxano[2]). Motores moleculares biológicos: replisoma mitocondrial humano. Las mitocondrias humanas contienen varias copias de un ADN circular de doble cadena (mtADN) que codifica, entre otras, 13 subunidades esenciales para el correcto funcionamiento del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS). La regulación de la expresión de mtADN implica diferentes niveles de control esenciales para la función mitocondrial y supervivencia celular. Uno de estos niveles de control es la replicación de mtADN. Dicha replicación se lleva a cabo mediante una maquinaria de replicación dedicada. En humanos, el replisoma de mtADN mínimo puede ser reconstituido in vitro con la polimerasa Pol γ, la proteína de unión al ADN de cadena sencilla mitocondrial (mtSSB) y la helicasa de ADN mitocondrial (también conocida como TWINKLE). Según el modelo de desplazamiento de banda para la replicación de mtADN, la replicación de mtADN de mamíferos es unidireccional y asimétrica: Pol γ y mtSSB interactúan funcionalmente en la realización de la síntesis de la cadena L desplazada, mientras que Pol γ, TWINKLE y mtSSB coordinan sus actividades para una síntesis eficiente de la cadena principal o cadena H. Según lo propuesto para los sistemas de replicación de ADN, durante la síntesis de la cadena principal (cadena pesada o cadena H en las mitocondrias), se cree que estas tres proteínas coordinan sus actividades en la horquilla de replicación mediante interacciones dinámicas funcionales, que son absolutamente necesarias para una síntesis de ADN eficiente y precisa. Hasta la fecha, se sabe poco acerca de cómo los tres componentes principales de la maquinaria de replicación de mtADN organizan sus actividades en la horquilla de replicación. Con el fin de comprender la base molecular de la sinergia y la coordinación entre la polimerasa mitocondrial, la helicasa y el SSB durante la síntesis de la cadena principal, en el segundo capítulo de esta tesis proponemos abordar las siguientes preguntas: ¿Cómo la helicasa acopla sus actividades de unión a ADN de cadena sencilla y de cadena doble con translocación y desenrrollamiento del ADN? ¿Cuál es el efecto de Pol γ en la cinética en tiempo real de la helicasa? ¿Cuál es el mecanismo utilizado por Pol γ para desestabilizar la horquilla? ¿Qué proteína desestabiliza la horquilla en mayor medida? ¿Cómo se ayudan entre sí las dos enzimas individuales? ¿Cómo modula el mtSSB la cinética en tiempo real de Pol γ y TWINKLE en la horquilla de replicación? ¿Cuál es el papel específico del mtSSB en la reacción? Interruptores moleculares sintéticos: rotaxano[2]. En las últimas décadas, los investigadores que trabajan en el campo de la química supramolecular han demostrado que los sistemas supramoleculares, debido a su organización estructural e integración funcional de sus componentes, pueden realizar tareas útiles. Ello demuestra que el concepto de un dispositivo puede transferirse a nivel molecular. En estos dispositivos moleculares, diferentes componentes de la molécula pueden cambiar sus posiciones relativas en respuesta a estímulos externos. Uno de los ejemplos más destacados de estos sistemas supramoleculares sintéticos son los interruptores moleculares basados en rotaxano. Estos dispositivos están compuestos por una cadena molecular rodeada por un macrociclo que puede moverse entre dos o más sitios de reconocimiento en la cadena, en respuesta a algún estímulo externo. Los interruptores moleculares son actualmente de gran interés para la investigación debido a sus posibles aplicaciones en diferentes campos, desde la biomedicina hasta la maquinaria molecular. El paso de las moléculas a la maquinaria molecular, que incorpora diferentes componentes moleculares para generar trabajo, requerirá un control exquisito de la dinámica y los procesos mecano-químicos que gobiernan el funcionamiento de estos sistemas a nanoescala. Aunque se conoce mucho sobre la termodinámica y la cinética de los rotaxanos en solución, todavía es necesaria una mejor comprensión de su dinámica operativa y propiedades mecano-químicas a nivel de moléculas individuales y aún quedan por responder preguntas muy básicas sobre el funcionamiento de los motores moleculares a nanoescala: ¿Cómo es la cinética (dinámica) en tiempo real del funcionamiento de un motor sintético? ¿Cómo responde la dinámica de los motores a estímulos externos como el estrés mecánico, las variaciones químicas, las fluctuaciones térmicas, la luz, etc.? ¿Cuánta fuerza puede ejercer un motor en particular? ¿Cuáles son los mecanismos mecano-químicos que gobiernan la operación del motor? ¿Cuáles son las eficiencias termodinámicas de los motores moleculares sintéticos? Responder a estas preguntas es de fundamental importancia para el diseño, uso y control de dispositivos eficientes basados en maquinaria molecular sintética capaces de llevar a cabo innumerables operaciones de forma continua. Sin embargo, hasta la fecha no existe una cuantificación experimental de la dinámica en tiempo real de los motores moleculares sintéticos, y se sabe muy poco acerca de sus propiedades mecano-químicas. Además, para aplicaciones nano-biotecnológicas, los motores moleculares sintéticos deberían funcionar en condiciones casi fisiológicas. Sus mecanismos operativos deben ser probados en condiciones acuosas y biocompatibles. En esta tesis, utilizamos pinzas ópticas para probar las propiedades mecánicas y estudiar la dinámica operativa de los interruptores moleculares individuales en dichas condiciones casi fisiológicas.