Vesículas extracelulares y Micro-ARN como biomarcadores de daño, reparación cerebral y recuperación en el infarto cerebral agudo

Resumen

El infarto cerebral es una de las principales causas de mortalidad y discapacidad en el mundo. Comprender los mecanismos de daño y reparación que se activan tras la isquemia cerebral aguda es fundamental para poder diseñar tratamientos encaminados a reparar el daño tisular y favorecer la recuperación funcional tras el ictus. Hasta ahora la mayoría de los estudios se han centrado en investigar el daño cortical neuronal, sin embargo, esta visión es simplista y el estudio de los mecanismos de daño y de reparación que surgen tras la afectación subcortical con lesión en fibras de sustancia blanca, células gliales y endotelio vascular es de suma importancia, puesto que la respuesta neuronal a la isquemia coexiste con respuesta glial y endotelial formando una unidad neuronal-glial-vascular en continua comunicación. En este sentido, el descubrimiento del importante papel de las vesículas extracelulares (VE) como vía de comunicación intercelular ha abierto un nuevo campo de investigación. Son vesículas de membrana del orden nanométrico secretadas por todos los tipos de células y que contienen una gran variabilidad de moléculas en su interior, entre las que se incluyen micro-ARN (miRNA) capaces de regular la expresión genética de células diana. Han sido halladas en la mayoría de los líquidos corporales y, por su pequeño tamaño, son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica, lo que las hace idóneas como biomarcadores de los procesos que están ocurriendo a nivel cerebral, sin necesidad de recurrir a técnicas invasivas. Además, una sola vesícula contiene una amplia variedad de moléculas en su interior, por lo que su estudio ofrecería el análisis de múltiples posibles biomarcadores. Otra ventaja es que su contenido depende de la población celular de la que deriven por lo que, dependiendo de la topografía de la lesión tisular, obtendríamos diferentes biomarcadores de daño y de reparación cerebral, que ayudarían a comprender los mecanismos subyacentes a la lesión isquémica según el tejido afectado. Hipótesis y objetivos Las VE que se liberan como parte de la respuesta celular a la isquemia podrían ser identificadas en la sangre de pacientes que hayan sufrido un infarto cerebral agudo. Éstas podrían contener proteínas y miRNA diferentes según la topografía del tejido cerebral dañado (córtico-subcortical o predominantemente subcortical). Su aislamiento, cuantificación y estudio de su composición podrían ser de utilidad en la predicción de la recuperación de los pacientes, al reflejar tanto los mecanismos patogénicos que subyacen al infarto cerebral, como los mecanismos compensadores y reparadores que se activan específicamente tras la isquemia cerebral. Para demostrar esta hipótesis nos planteamos los siguientes objetivos: Estudiar las VE en el proceso isquémico, evaluando si existen diferencias en sus niveles séricos o en su contenido en proteínas y miRNA entre pacientes con isquemia (cerebral o de miocardio) y voluntarios sanos. Explorar si existen diferencias en los niveles séricos o en el contenido en proteínas y miRNA de las VE dependiendo del órgano afectado por isquemia. Analizar las posibles diferencias en los niveles séricos de las VE o en su contenido en proteínas y miRNA en pacientes con infarto córtico-subcortical en comparación con el infarto cerebral de afectación estrictamente subcortical. Evaluar la potencial utilidad de las VE como biomarcadores en la isquemia cerebral, analizando si existe correlación entre sus niveles séricos y el volumen del infarto cerebral o la recuperación neurológica, y si existe algún miRNA que permita predecir buena evolución de los pacientes con ictus isquémico agudo. Materiales y Métodos El estudio se ha diseñado como un estudio clínico prospectivo y observacional caso-control. Población y grupos de estudio: un grupo de casos (infarto cerebral agudo) y dos grupos control: voluntario sano (VS) e infarto agudo de miocardio (IAM). Dentro del grupo de casos distinguimos dos subgrupos: infarto cerebral córtico-subcortical (IC-cs) e infarto cerebral subcortical (IC-s). Las VE se han aislado del suero por un procedimiento de precipitación. Se han caracterizado por tres métodos (western blot, análisis de seguimiento de nanopartículas y microscopía electrónica). Una vez aisladas, se han cuantificado mediante ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Por último, se ha estudiado el contenido en proteínas por espectrometría de masas (MS) y de miRNA por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-qPCR). Como marcador de daño cerebral se ha utilizado el volumen de lesión por resonancia magnética (RM). Para evaluar la recuperación neurológica, se ha utilizado la escala NIHSS a las 24h y a los tres meses y la escala de Rankin modificada (ERm) a los tres meses. Se consideró buena recuperación neurológica una reducción relativa en la escala de NIHSS superior al 50%, utilizando la siguiente fórmula: RR NIHSS=(1-(NIHSS a los 3 meses÷NIHSS inicial))*100 Donde RR NIHSS es la reducción relativa en la puntuación en la escala de NIHSS, NIHSS a los tres meses es la puntuación en la escala obtenida a los tres meses en la consulta del neurólogo y NIHSS inicial es la puntuación en la escala obtenida en la exploración realizada por el neurólogo de guardia en el momento de la llegada del paciente a Urgencias. Resultados La muestra final del estudio fue de 140 sujetos: 22 VS, 37 IAM y 81 pacientes con infarto cerebral agudo (26 IC-s y 55 IC-cs). Encontramos diferencias en la edad (siendo mayores los pacientes con IC-cs que el resto de grupos), en el sexo (con mayor frecuencia de varones en los grupos IAM e IC-s) y en la presencia de factores de riesgo vascular como la hipertensión arterial y la dislipidemia (más frecuentes en los pacientes con IC-cs, IC-s e IAM en comparación a VS), así como el tabaquismo (más frecuente en los pacientes con IAM en comparación al resto de grupos). Observamos niveles de VE más elevados en pacientes con isquemia (cerebral o miocárdica) (3,07x109 [±2,91x109] VE/mL) en comparación a VS (2,30x109 [±2,70x109] VE/mL), aunque no se llegó a alcanzar la significación estadística (p=0,051). En el análisis de proteómica identificamos diferencias entre los pacientes con isquemia y los VS en la expresión de catorce proteínas (apolipoproteína L1, apolipoproteína C1, proteína C reactiva, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, proteína C4a del complemento, lectina de unión a la manosa, loricrina, cadena alfa 1b de tubulina, desmogleína-1, desmocolina-1, proteína 32 piel-específica, hornerina, alfa-2-glicoproteína rica en leucina, factor IX de la coagulación) y de seis miRNA (miRNA-340_5p, miRNA-424_5p, miRNA-199a_3p, miRNA-369_3p y miRNA-339_5p). Al comparar la isquemia cerebral frente a la miocárdica, no detectamos diferencias entre los niveles de VE en los pacientes con infarto cerebral (3,07x109 [±3,17x109] VE/mL) y en aquellos con IAM (3,05x109 [±2,36x109] VE/mL). Al analizar el contenido de proteínas en las VE de los pacientes con isquemia cerebral y miocárdica, se identificaron 42 proteínas específicas en el grupo de pacientes con infarto cerebral. Se observó mayor expresión de miRNA-340_5p en pacientes con infarto cerebral en comparación a pacientes con IAM (p<0,05). Cuando analizamos las diferencias en los niveles séricos de las VE en función de la topografía de la lesión cerebral (afectación córtico-subcortical o afectación estrictamente subcortical) observamos niveles discretamente más elevados en los pacientes con IC-cs (3,27x10 9 [±3,3 x10 9] VE/mL) frente a pacientes con IC-s (2,67x109 [±2,91x109] VE/mL), pero estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p=0,119). En el grupo de pacientes con IC-cs, identificamos siete proteínas específicas de grupo: subunidad A del subcomponente C1q del complemento (C1QA), región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina 3-43 (IGHV3-43), región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina 2-26 (IGHV2-26), arginasa-1 (ARG1), proteína 138 que contiene el dominio en espiral (CCDC138), properdina (CFP), caspasa-14 (CASP14). En el grupo de IC-s hallamos 25 proteínas que no se encontraban presentes en el grupo IC-cs: cadena ligera tipo kappa de inmunoglobulina (IGKC), región variable de cadena ligera kappa de inmunoglobulina 2-24 (IGKV2-24), alfa-2 antiplasmina (SERPINF2), titina (TTN), talina 1 (TLN1), factor de complemento B (CFB), alfa-1 glicoproteína ácida 2 (ORM2), fibulina-1 (FBLN1), ficolina-2 (FCN2), anexina A2 (ANXA2), dermicidina (DCD), colectina 11 (colec11), placofilina-1 (PKP1), región variable de cadena ligera kappa de inmunoglobulina 1-17(IGKV1-17), trombospondina-4 (THBS4), integrina alfa-IIb (ITGA2B), filamina-A (FLNA), proteína transportadora de casete unida a ATP A1 (ABCA1), proteína 2 con dominio LIM similar al antígeno de senescencia (LIMS2), selenoproteína P (SELENOP), homólogo de la familia de fermitina 3 (FERMT3), subunidad gamma del factor 8 del complemento (C8G), fosfolipasa D específica de fosfatidilinositol-glicano (GPLD1), proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP1) y miosina Vb (MYO5b). En el análisis de miRNA detectamos infraexpresión de cuatro miRNA: miRNA-15a_5p, miRNA-424_5p, miRNA-100_5p y miRNA-339_5p en el grupo de IC-cs. Por último, estudiamos si las VE podrían ser de utilidad como biomarcadores de recuperación neurológica en la isquemia cerebral. Aunque los niveles séricos de VE no se correlacionaron con la recuperación en pacientes ni con el volumen de lesión, sí encontramos asociación en el contenido de miRNA de las VE y la recuperación clínica. En este sentido, la expresión de miRNA-100_5p por debajo de un punto de corte de 5,47 Delta CT y de miRNA-29b_3p por debajo de un punto de corte de 2,52 Delta CT, se asociaron a buena recuperación neurológica a los tres meses en pacientes con infarto cerebral agudo. Conclusiones En este proyecto de investigación clínica en el que hemos estudiado el papel de las VE y de los miRNA como potenciales biomarcadores pronósticos en pacientes con infarto cerebral agudo, nuestros resultados muestran que: 1.En el daño isquémico (cerebral y miocárdico) existe un incremento de los niveles de VE en suero, con un perfil de expresión en miRNA y proteínas diferente al hallado en controles sanos. 2.No existen diferencias en los niveles séricos de VE en isquemia cerebral y miocárdica, aunque sí en la expresión de proteínas y miRNA. Se han identificado 42 proteínas específicas de pacientes con infarto cerebral y miRNA-340_5p se encuentra sobreexpresado en el infarto cerebral en comparación con infarto de miocardio. Estas diferencias sugieren que, aunque existan proteínas y miRNA comunes al proceso isquémico, existen diferencias en los mecanismos de daño y de reparación tisular que subyacen a la isquemia cerebral y a la miocárdica. 3.No existen diferencias significativas en los niveles séricos de VE en pacientes con IC-cs en comparación con los de IC-s. Sin embargo, se han identificado proteínas específicas de grupo tanto en el IC-cs como en el IC-s. Además, detectamos infraexpresión de cuatro miRNA: miRNA-15a_5p, miRNA-424_5p, miRNA-100_5p y miRNA-339_5p en el grupo de IC-cs. Todo ello sugiere diferencias en los mecanismos de daño y de reparación cerebral según la topografía de la lesión cerebral. 4.Los niveles séricos de VE no se correlacionan con el volumen de lesión ni con la recuperación neurológica tras un infarto cerebral. Sin embargo, tanto niveles de miRNA-29b_3p inferiores a 2,52 Delta CT como de miRNA-100_5p por debajo de 5,47 Delta CT predicen buena recuperación neurológica a los tres meses, por lo que podrían tener valor como biomarcadores pronósticos en pacientes con infarto cerebral agudo.