Desarrollo y validación experimental de un método para la obtención de estructuras de complejos ligando/receptor basado en resonancia magnética nuclear

Resumen

El conocimiento estructural de los complejos moleculares entre proteínas y moléculas pequeñas permite obtener información útil para el estudio de la maquinaria celular. Entre los complejos moleculares, existen muchas interacciones de baja afinidad que regulan interacciones transitorias. La resolución estructural de estos complejos proteína-ligando de baja afinidad tiene vital importancia, por su relevancia en los mecanismos de regulación celular. No obstante, la resolución estructural es ardua y en muchos casos llega a ser inviable debido a sus bajas constantes de asociación. En estas condiciones, es difícil extraer información estructural suficiente por DRX o crio-ME para poder resolver analíticamente la estructura de los complejos. Sin embargo, diversas técnicas de RMN permiten extraer parte de la información estructural de este tipo de complejos. Con objeto de resolver complejos moleculares controlados por un intercambio químico rápido, se diseñó una metodología híbrida basada en datos de RMN y DRX capaz de abarcar la resolución estructural de complejos proteína-ligando con bajas constantes de asociación. La metodología combina datos estructurales cristalográficos de la proteína, datos conformacionales del ligando obtenidos por TR-NOESY y datos del contacto entre la proteína y el ligando obtenidos mediante STD-NMR, para resolver la estructura de complejos proteína-ligando de baja afinidad. Para combinar los datos de STD-NMR con el resto de las técnicas es necesario el desarrollo de una metodología fiable que determine automáticamente la orientación del ligando en el sitio de unión. Por ello se diseñaron nuevas variantes de la función de error residual entre los datos experimentales y los modelos de estructuras generadas para evaluar la calidad de los modelos. Estas variantes del factor junto con el factor R-NOE clásico se implementaron en el programa STD-MaPa. STD-MaPa es el núcleo de la metodología híbrida de RMN-DRX y fue creado para automatizar el acoplamiento guiado por datos de STD-NMR de las moléculas de ligando en el sitio activo conocido de los complejos proteína-ligando. La metodología implementada en el programa fue probada usando como referencia cinco complejos moleculares que tienen sus estructuras resueltas por DRX y cuyos datos de STD-NMR eran conocidos. El STD-MaPa resolvió correctamente las cinco estructuras cristalográficas. Por último, se estudió la estructura de la dactilolida unida al tetrámero de a,b-tubulina. La dactilolida forma parte de una nueva familia de fármacos capaces de unirse covalentemente a la b-tubulina evitando así la resistencia tumoral por sobreexpresión de bombas de membrana. Este fármaco se une covalentemente a la proteína pero esta unión, presenta una cinética de asociación muy lenta, lo que impide su resolución estructural por DRX. En este trabajo se consiguió resolver la estructura de la dactilolida unida no covalentemente al tetrámero de a,b-tubulina (T2R) con la metodología híbrida RMN-DRX. Además, se identificaron dos orientaciones en la subunidad de b-tubulina menos accesible del cristal del tetrámero T2R en una proporción del 83% y 17%. Analizando la orientación predominante y la estructura cristalográfica de su homólogo estructural zampanolida se pudo describir el mecanismo de reacción covalente de esta familia de fármacos para la unión a la b-tubulina. Este mecanismo permitirá el diseño de nuevos fármacos que presenten la unión covalente y puedan eludir los mecanismos de resistencia a fármacos de las células cancerígenas.