Estabilización de Penicilina G acilasa por inmovilización covalente multipuntual dirigida mutagénesis de la superficie de la enzima para mejorar la complementariedad enzima-soporte activado

Resumen

En esta tesis se propone una nueva estrategia para alcanzar un alto grado de estabilización de enzimas industriales: la rigidificación orientada muy intensa de una determinada región de la superficie enzimática por medio de la optimización de la unión covalente multipuntual sobre soportes activados pre-existentes. El principal objetivo de esta tesis doctoral involucró el desarrollo de los siguientes sub-objetivos: a.- La preparación a medida de soportes disulfuro-epóxido conteniendo: i)- una pequeña proporción de grupos tiol-reactivos capaces de inmovilizar de forma selectiva a la enzima a través de residuos de cisteína insertados en la superficie proteica; ii)- una alta concentración de grupos epóxido capaces de realizar una intensa unión covalente irreversible multipuntual con grupos nucleófilos de la superficie proteica cercanos a la zona donde se introdujo el residuo de cisteína. A su vez, se llevo a cabo la optimización del proceso de unión covalente multipunutal en los soportes mixtos desarrollados. b.- La obtención de distintos mutantes, conteniendo un residuo de cisteína en distintas regiones de la superficie proteica con alto contenido nativo en lisinas. Con este fin se evaluó la estructura tridimensional de la penicilina G acilasa (PGA) de E. coli, y se seleccionaron distintos aminoácidos donde realizar la mutación. Después de evaluar a través de simulación por dinámica molecular que la introducción de las distintas mutaciones no provocaba alteraciones en la conformación de la enzima, los mutantes seleccionados fueron obtenidos por mutagénesis dirigida. c.- La rigidificación orientada de cada uno de los distintos mutantes, con el fin de poder detectar zonas de la superficie proteica más sensibles a la estabilización, la cual resultó ser una región cercana al centro activo de la enzima (región cercana al residuo B380 de la enzima). d.- El enriquecimiento en residuos de lisina de la z