Meta-genómica aplicada a estudios estructura-función en comunidades microbianas de diferentes sistemas acuáticos

Resumen

La presente tesis Doctoral emplea técnicas metagenómicas para la identificación de enzimas novedosas y versátiles, que incluyen esterasas/lipasas, glicosidasas, aldo-ceto reductasas y lactato dehidrogenasas. A través de esta Tesis se ha accedido a una amplia diversidad enzimática mediante el uso de estrategias de rastreo de actividad enzimática en librerías de clones. Dichas librerías se han creado a partir de DNA extraído de comunidades microbianas de diferente procedencia, que se distinguen claramente de otros trabajos realizados con anterioridad en la literatura científica. El objetivo principal es proporcionar a través de rastreos enzimáticos una amplia colección de enzimas, y un entendimiento detallado de las carácterísticas de las mismas en el marco de las condiciones geoquímicas que caracterizan los hábitats de procedencia, y los mecanismos subyacentes a la actividad de las enzimas. Estos objetivos ambiciosos se han conseguido mediante el empleo de: (1) rastreos funcionales, con sustratos modelo, de librerías metagenómicas empleando muestras de alta y muy diferente biodiversidad para acceder a un mayor número de clones positivos; (2) rastreos en las secuencias obtenidas de los clones positivos de secuencias correspondientes a las enzimas objeto de estudio; y (3) una amplia base de datos de secuencias, y datos bioquímicos y estructurales de las enzimas estudiadas. Las enzimas seleccionadas han sido caracterizadas bioquímicamente y aquellas más prometedoras se sometieron a fermentaciones con alta densidad celular y técnicas de modelado y cristalización. En particular, en la presente Tesis Doctoral se han identificado y caracterizado 25 nuevas enzimas (22 esterasas/lipasas, 1 beta-glucosidasa, 1 aldo-ceto reductasa, y 1 (L)-lactato dehidrogenasa) de metagenomas creados a partir de DNA de comunidades microbianas procedentes de 8 hábitats diferentes y un genoma de una bacteria cultivable. En particular de: i) cuatro fosas marinas (Medee, Kryos, Bannock y Matapan) del Este del Mar Mediterráneo (3 de ellas hipersalinas); ii) un lago cárstico (Lago Arreo); iii) el microbioma de agallas de una gamba (Rimicaris exoculata) que viene a 2,320 m de profundidad en la zona cercana a un fuente hidrotermal en la Dorsal Mesoatlántica; iv) agua marina superficial contaminada con crudo cercana a la Isla de Kolguev en el Mar de Barents; v) una fuente hidrotermal no profunda en la Isla de San Pablo (Alaska); y vi) de la bacteria marina hidrocarbonoclástica, Cycloclasticus sp. ME7. La temperatura, salinidad y profundidad de los hábitats estudiados oscila entre 4-16.5ºC, entre 1.1 y 348 g/kg y entre 0 y 4,908 m, respectivamente. Las características geoquímicas de estos hábitats los convierten en ejemplos de ambientes poco explorados a nivel enzimático y la amplia diversidad de factores ambientales, en particular, salinidad, temperatura y presión, los conviertes en hábitats adecuados para estudios estructura-función, adaptaciones a medios extremos y análisis de promiscuidad catalítica. El tamaño medio de las librerías sometidas a rastreos funcionales oscila entre 120 y 816 Mbp, y el número de clones positivos para las actividades de interés por genoteca oscila entre 1:667 a 1:15,000. La masa molecular y el punto isoeléctrico de las enzimas estudiadas oscila entre 24,190 y 84,278 Da, y 4.66 y 10.04, respectivamente. A nivel de secuencia las enzimas identificadas y analizadas presentan homologías a nivel de identidad entre el 25% y el 99% en comparación con otras descritas. La temperatura óptima de actividad oscila entre los 12 y los 75ºC y las concentraciones de sal (NaCl) para actividad óptima varían entre 0 y 4.0 M. La mayoría de las enzimas proceden de bacterias del filo Proteobacteria (18), seguido de Tenericutes (5) y Firmicutes (1); en uno de los casos, no fue posible sugerir la posible bacteria de origen. El estudio comparativo de las enzimas identificadas no solo ha proporcionado la mayor colección (25) y mayor número de estructuras (6) de enzimas de ambientes acuáticos (incluídos ambientes marinos profundos), sino también un amplio conocimiento de nuevas reactividades y adaptaciones de las mismas. En particular conviene destacar la identificación y caracterización de enzimas con actividad dual esterasa: C-C hidrolasa, así como la presencia de enzimas termo-activas y termo-resistentes en ambientes marinos profundos donde la temperatura no es superior a 16.5ºC. Los datos presentados en esta Tesis Doctoral demuestran una relación directa entre la resistencia a la presión y un aumento en la temperatura óptima y de desnaturalización en enzimas de microorganismos aislados de ambientes marinos profundos hiper-salinos. Así mismo cabe mencionar que el análisis exhaustivo de las reactividades con un set de más de 210 sustratos diferentes ha proporcionado un amplio conocimiento de los niveles de promiscuidad de las enzimas de diferentes hábitats entre sí y con enzimas comerciales y descritas en la literatura científica. Los resultados presentados en esta Tesis Doctoral no solo apuntan a la existencia de especificidades inusuales de interés biotecnológico, sino también indican que las enzimas de un mismo hábitat presentan, por lo general, reactividades parecidas.