Evolución dirigida de la peroxidasa versátil para el diseño de una levadura de podredumbre blanca

Resumen

Resumen El papel que desempeña la peroxidasa versátil (VP) en el proceso de despolimerización de la lignina ha despertado un gran interés biotecnológico para su aplicación en el pre-tratamiento de la biomasa lignocelulósica. Las VPs son hemoproteínas dependientes de H2O2 que presentan una alta promiscuidad de sustrato, pudiendo oxidar un amplio rango de compuestos fenólicos y no fenólicos de alto, medio y bajo potencial redox. La estructura de la VP se encuentra estabilizada por la presencia de dos calcios estructurales que mantienen la actividad de sus tres sitios catalíticos: un canal principal de acceso al grupo hemo, un sitio de oxidación de Mn2+ y un sitio de oxidación gobernado por un triptófano catalítico superficial. Estas características estructurales parecen haber sido adquiridas durante la evolución natural de la VP a partir de MnP (Manganeso peroxidasa) atípicas de origen Paleozoico. Con el fin de mejorar las propiedades de la VP para sus posibles aplicaciones en el contexto de las biorefinerías lignocelulósicas, la expresión funcional heteróloga de la VP en hospedadores apropiados de evolución dirigida es fundamental. En segundo lugar, entre las características que requieren una urgente revisión en la VP se encuentran su pobre estabilidad oxidativa frente a H2O2 (un proceso común a todas las hemo-peroxidasas, que es dependiente del mecanismo de acción de la enzima) y su nula actividad y estabilidad a pH neutro/alcalino, como consecuencia del proceso de selección natural que han cursado para funcionar en ambientes ácidos durante la degradación de lignina. Haciendo uso de la evolución dirigida en la levadura Saccharomyces cerevisiae como hospedador heterólogo, se diseñó la VP de Pleurotus eryngii hacia expresión funcional, y seguidamente hacia termoestabilidad. El mutante R4 aumentó sus niveles de secreción en levadura ~129 veces (22 mg/L) respecto al parental, mientras que el mutante de termoestabilidad (variante 2-1B) incrementó su termoestabilidad en 8 ºC. Inesperadamente, R4 también mostró un aumentoen su estabilidad oxidativa, por lo que fue seleccionado como punto de partida para mejorar suresistencia a H2O2. Para ello, se utilizaron diferentes herramientas in vivo e in vitro durante lageneración de las librerías mutagénicas, incluyendo dos nuevas técnicas llamas MORPHING yDNApuzzle. El protocolo de MORPHING consistió en enfocar la carga mutagénica y los eventos derecombinación, específicamente sobre tres regiones potencialmente implicadas en la inactivaciónpor peróxidos, mientras que el DNApuzzle se aplicó como último paso de evolución con la idea deseleccionar la mejor combinación de mutaciones encontradas, mediante la recombinación debloques de secuencia evolucionados en diferentes estadios. Finalmente se obtuvieron dosvariantes (AT-AT y SIth) con 7 y 8 mutaciones cada una que mejoraron sus vidas medias de 3 min(parental) hasta 18 y 35 min, respectivamente, en presencia de 3000 equivalentes de H2O2.Además, el mutante SIth, también aumentó su termoestabilidad en 6 ºC. Las mutacionesencontradas en este trabajo se analizaron junto con otras peroxidasas resistentes a peróxidos,proponiendo posibles mecanismos y vías de estabilización oxidativa. Por otro lado, el mutante de termoestabilidad 2-1B presentó una inusual elevada estabilidad frente a pHs alcalinos tras el proceso de evolución como consecuencia de un eje estabilizante constituido por tres mutaciones, que favorecieron la conservación de los calcios estructurales bajo pH alcalinos. A pesar de que 2-1B fue estable a pH alcalino, no mostró actividad detectable más allá de pH 5.0. Tomando ventaja de su estabilidad alcalina, 2-1B fue evolucionado hacia actividad a pH neutro/alcalino. El mutante resultante de dicha proceso (variante BB-8), acumuló tres mutaciones que le dotaron de actividad a pHs neutros/alcalinos frente a diferentes sustratos de bajo potencial redox, tanto en el canal del hemo como en el sitio del Mn2+, mientras que el Trp catalítico fue inactivo a pH alcalino debido a que su funcionamiento es dependiente de su estado de ionización y potencial redox a pH ácidos. La incorporación de una mutación en las proximidades del sitio de unión de Mn2+, afectó negativamente las propiedades catalíticas de este sitio, efecto que se vio compensado por la capacidad de oxidar ABTS a pH alcalino en dicho centro catalítico de manera directa, lo cual nunca antes había sido reportado en la VP. Además, también se detectó un fenómeno de hiperactivación enzimática tras la incubación de BB-8 a pH alcalino. Por último, el mutante termoestable 2-1B y una lacasa de alto potencial redox previamente evolucionada (primero hacia expresión funcional en S. cerevisiae, y más tarde hacia tolerancia a sangre humana), fueron co-expresados en S. cerevisiae con la intención de crear un prototipo inicial de levadura de podredumbre blanca (WRY). La co-expresión de ambos genes se llevó a cabo en formato de microplaca y matraz, mediante el uso de construcciones basadas en vectores bi-direccionales controlados por diferentes cassettes de expresión (GAL1/CYC1 y GAL10/ADH1). Los resultados de este trabajo mostraron la posibilidad de co-expresar ambos genes en S. cerevisiae sin interferir significativamente el metabolismo de la célula. Se comprobó que la co-expresión de ambas enzimas en levadura se ve disminuida entre 4 y 10 veces (dependiendo de la enzima y el formato de cultivo) frente a la expresión individual de cada una de ellas. En cualquier caso, los niveles de co-expresión más altos y equitativos, para VP y lacasa, se obtuvieron con la construcción GAL1/VP/CYC1-GAL10/Lacasa/ADH1, donde las actividades reportadas fueron ~ 175 U/L (microplaca) y 30 U/L (matraz) para la VP y la lacasa, respectivamente. Este prototipo de WRY podría ser mejorado en un futuro próximo incorporando un aparato ligninolítico más elaborado que, junto con un aparato celulolítico, permitiese abordar el diseño de un organismo sintético capaz de transformar el material lignocelulósico en biocombustibles o compuestos químicos de alto valor añadido. Desde una perspectiva fundamental, podría servir además de modelo de estudio aplicado a hongos de podredumbre blanca selectivos y/o simultáneos.