Identificación y caracterización molecular de mutaciones en pacientes con enfermedad de Pompe. Análisis del transcriptoma de sangre periférica

Resumen

La Glucogenosis tipo II, también conocida como enfermedad de Pompe, es una enfermedad genética con un patrón de herencia autosómico recesivo, producida por el déficit de la enzima alfa glucosidasa acida lisosomal, responsable de la ruptura del glucógeno en esa organela subcelular. Es una patología con una gran variabilidad clínica, que depende principalmente del grado de actividad enzimática residual, lo que dificulta de manera apreciable el diagnóstico y condiciona su evolución. En este trabajo hemos estudiado una cohorte de 259 pacientes con sospecha de padecer la enfermedad. Para ello, hemos puesto a punto un abordaje mediante secuenciación Sanger de las regiones exónicas e intrónicas flanqueantes del gen GAA. Para identificar algunos tipos de reordenamientos complejos hemos enriquecido el estudio con un MLPA de diseño propio. Esta aproximación nos ha permitido alcanzar un diagnóstico genético confirmatorio en 76 pacientes, detectando 20 variantes nuevas, no descritas anteriormente, de las que 2 son deleciones detectadas gracias al MLPA, una de ellas afecta a la estructura completa del gen GAA y parte del gen contiguo CCDC40, siendo la mayor descrita hasta el momento. Además, la mutación c.-32-13T>G ha sido identificada en el 84,3% de los pacientes con la forma tardía de la enfermedad. Hemos realizado la caracterización funcional de 16 variantes, para explorar su potencial implicación en el procesamiento del mRNA. El método utilizado pone de manifiesto tanto alteraciones cualitativas como cuantitativas que afectan al rendimiento y la calidad del mRNA resultante de un alelo mutado. Esto nos ha permitido dilucidar el papel de 7 de estas variantes en un procesamiento aberrante del RNA mensajero. Entre ellas, hemos detectado la implicación en el procesamiento de la variante missense c.1704C>G (p.H568Q), de la nonsense c.343C>T (p.Q115*), de la variante sinónima c.546G>C (p.T182T), así como de las variantes que afectan a sitios canónicos de splicing c.1075+1G>A, c.1637-2delA y c.1889-1G>A. También hemos podido establecer la implicación de la variante c.1194+5G>A en el procesamiento aberrante del mRNA y, de ese modo, determinar su patogenicidad. Antes de este trabajo esta variante era considerada como no patogénica. El análisis de transcriptoma en células de sangre periférica ha permitido determinar la desregulación de rutas relacionadas con la respuesta inmune, como la vía de señalización de TNFa a través de NFKB, así como la apoptosis, entre otras. Asimismo, se ha detectado una desregulación del sistema ubiquitina-proteasoma, implicado principalmente en la degradación de proteínas intracelulares. Las diferencias de expresión observadas con grupos seleccionados de genes han permitido una agrupación no supervisada, capaz de discriminar entre pacientes y controles. Esta puede ser la base para obtener una firma génica y ayudar en la búsqueda de nuevos biomarcadores.