Novel treatment strategies for chronic respiratory infections based on the analysis of antimicrobial resistance dynamics in pseudomonas aeruginosa biofilms

Résumé

Pseudomonas aeruginosa és la principal causa d`infeccions respiratòries (IRC) i el principal responsable de l´elevada morbiditat i mortalitat dels pacients amb fibrosi quística (FQ). La instauració de la IRC requereix un complex procés adaptatiu que inclou la selecció d´un número important de mutacions, necessàries per la persistència a llarg termini i comporta la transició des de el mode de creixement planctònic al de biopel·lícula, un segell distintiu de les infeccions cròniques. La complexa estructura espacial de les biopel·lícules junt amb la pressió selectiva d´antibiòtics donen lloc a l´evolució de comunitats heterogènies conformades per diferents subpoblacions que coexisteixen e interactuen establint diversos comportament socials. A més, els perllongats tractaments antibiòtics empleats en la IRC comporten, inevitablement, un augment de la resistència. Les estratègies terapèutiques tradicionals per controlar la infecció per P. aeruginosa amb pacients amb FQ estan basades en l´ús d´un únic antibiòtic nebulitzat i semblen ser eficaços amb el pas del temps. En primer lloc, aquest treball va determinar si els mutants resistents de P. aeruginosa mostraven comportaments egoistes o altruistes en ser estudiats amb biopel·lícules mixtes durant el tractament antibiòtic. Es van utilitzar per l´estudi de biopel·lícules simples o mixtes la soca PAO1 marcada amb ECFP i derivats marcats amb EYFP que híper produïen -lactamasa AmpC o la bomba d´expulsió MexAB-OprM. Les biopel·lícules madures van ser exposades a diferents concentracions de -lactàmics per monitoritzar la dinàmica estructural, utilitzant microscopía làser confocal (CLSM) i la dinàmica poblacional, a través del recompte de cèl·lules viables. Si bé el tractament amb -lactàmics de biopel·lícules formades amb PAO1 condueix a una reducció important de la càrrega bacteriana, va tenir poc efecte sobre les biopel·lícules formades per els mutants resistents. No obstant, el descobriment més revelador , va ser que la càrrega bacteriana de PAO1 va augmentar significativament quan creixia amb biopel·lícules mixtes, amb comparació amb biopel·lícules individuals. D´acord amb els recomptes de cèl·lules viables , les imatges CLSM van mostrar l´amplificació dels mutants resistents i la protecció sobre les poblacions susceptibles. Aquets descobriments demostren per primera vegada que els mutants que expressen diversos mecanismes de resistència, tant de híper producció de -lactamases com híper expressió de bombes de flux, protegeixen a tota la comunitat, preservant a les poblacions susceptibles de l´efecte dels antibiòtics. Per últim, aquest treball també va avaluar l’eficàcia terapèutica i la dinàmica de la resistència els antibiòtics amb biopel·lícules exposades a tractament seqüencial amb aztreonam (ATM) i tobramicina (TOB) simulant la teràpia inhalada. Per el seu estudi es van desenvolupar biopel·licules de soques clínics i de laboratori utilitzant el sistema del cel·la de flux. Les biopel·lícules madures van ser tractades amb diferents concentracions de ATM i TOB i les seves alternances a diferents temps. Es va determinar tant el número de cèl·lules viables com de mutants resistents i es va controlar la dinàmica estructural de les biopel·lícules mitjançant CLSM. La monoteràpia amb TOB va produir una intensa disminució de les cèl·lules viables, que no sempre es va correlacionar amb una reducció de la biomassa i/o l’efecte bactericida sobre les biopel·lícules, particularment per les soques de FQ. L’efecte bactericida de la monoteràpia amb ATM va ser menor, però va tenir efecte sobre la biomassa i/o l’estructura de les biopel·lícules, afegint un intens efecte de filamentació. L’alternança de TOB i ATM va suposar una millora de l’activitat antibiopel·lícula tant davant les soques clínics com del laboratori, amb comparació amb el règims individuals, potenciant l’efecte bactericida i/o la reducció de la biomassa. Aquests resultats secunden l’avaluació clínica de règims seqüencials amb antibiòtics inhalats en la FQ, a diferencia dels tractaments de manteniment actuals que utilitzen un sol antibiòtic en monoteràpia. En general aquest treball proporciona nous coneixements sobre la complexitat del desenvolupament de resistència en les biopel·lícules, destacant la importància dels mutants resistents dins de les poblacions heterogènies, i també representen un pas endavant per el desenvolupament de noves estratègies que puguin combatre la IRC per P.aeruginosa