Estudio secuencial y cuantitativo del quimerismo hemopoyético en pacientes sometidos a un trasplante alogénico de progenitores hemopoyéticos con depleción linfoide T o con acondicionamiento sub-mieloablativo.

Abstract

El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es analizar cual es la frecuencia y la relevancia clínica de la persistencia de células linfoides T y de células mieloides originarias del receptor (quimerismo mixto) tras un trasplante alogénico de progenitores hemopoyéticos. La hipótesis de trabajo es comprobar si el estudio secuencial y cuantitativo del patrón de quimerismo mixto en linfocitos T y en neutrófilos permite predecir el rechazo del injerto alogénico o la recidiva leucémica, respectivamente. Para ello se ha estudiado el quimerismo hemopoyético en dos grupos de pacientes: 1. Pacientes tratados con un trasplante alogénico en el que se eliminan de forma parcial los linfocitos T del inóculo (alo-TSP/ELT) mediante selección positiva de las células CD34+. 2. Pacientes que recibieron un trasplante alogénico con acondicionamiento de intensidad reducida de tipo no mieloablativo (alo-TIR no mieloablativo). En nuestros estudios hemos aplicado una técnica molecular basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el análisis automatizado de fragmentos de ADN repetitivos en tandem o microsatélites (PCR/STR multiplex), la cual permite analizar cuál es el componente del donante y del receptor en diferentes líneas celulares, así como un estudio cuantitativo de cada una de ellas. Las muestras analizadas fueron obtenidas de forma secuencial a partir de la sangre periférica. Para el análisis del quimerismo mediante PCR/STR utilizamos un preparado comercial (AmpFlSTR Profiler Plus PCR; Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) que analiza nueve STR: D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, y un segmento del gen de la amelogenina para distinguir el cromosoma X o Y. La separación y detección de los productos amplificados por PCR se llevó a cabo mediante un secuenciador automático de ADN (ABI Prism 310 automated DNA sequencer; Applied Biosystems). El tamaño de los fragmentos se detecta automáticamente mediante dos métodos informáticos (ABI Prism GeneScan 2.0 y GenoTyper; Applied Biosystems). La tinción con diferentes colores permite identificar alelos de tamaño muy similar. Por último, la cuantificación del quimerismo mixto se efectúa calculando el porcentaje de componente del donante y del receptor utilizando unas fórmulas matemáticas específicas. Se considera quimerismo mixto cuando el porcentaje de linfocitos T o de neutrófilos del receptor es superior al 5%. La sensibilidad de la PCR/STR se sitúa entre el 1-5%. Las conclusiones de los dos estudios incluidos en esta Tesis Doctoral fueron: 1. La técnica de la PCR/STR permite realizar un análisis secuencial y cuantitativo del quimerismo hemopoyético tras el trasplante alogénico de progenitores hemopoyéticos con un nivel de sensibilidad suficiente. 2. La eliminación de linfocitos T del producto de leucaféresis mediante selección positiva de las células CD34+ se asocia a un aumento significativo de la frecuencia de quimerismo mixto en linfocitos T, el cual puede ser predictivo de fallo de implante. En este mismo contexto, el quimerismo mixto mieloide se asocia a recidiva leucémica en pacientes con hemopatías malignas que afectan a esta línea celular (ej. leucemia mieloide crónica). 3. El régimen de acondicionamiento no mieloablativo con fludarabina e irradiación corporal total 2 Gy permite alcanzar un implante hemopoyético completo y mantenido, pero con un retraso significativo del injerto en el compartimiento linfoide T, por lo que puede ser útil en pacientes con enfermedades malignas con índice proliferativo bajo o en remisión, pero ineficaz para el control de enfermedades hematológicas malignas en progresión.