Interrelaciones del complejo de cohesina, la recombinación y la sinapsis en la meiosis de Ortópteros

Resumen

La meiosis es un tipo especializado de división celular mediante el cual los organismos con reproducción sexual mantienen su número cromosómico generación tras generación. En este proceso se generan gametos haploides después de dos rondas sucesivas de segregación cromosómica, entre las cuales no se produce replicación de ADN. Durante la primera profase meiótica, los cromosomas homólogos forman bivalentes estables como consecuencia de un reconocimiento previo entre cada par de homólogos y su posterior alineamiento (apareamiento), sinapsis (asociación íntima de los cromosomas apareados mediante las proteínas que forman parte del complejo sinaptonémico) y recombinación (intercambio de regiones cromosómicas). Las conexiones físicas entre los cromosomas homólogos, producidas como consecuencia de sucesos de recombinación recíproca (quiasmas), así como la cohesión entre cromátidas hermanas, mediada principalmente por el complejo de cohesina, son procesos esenciales para la estabilización de los bivalentes en metafase I y la correcta segregación de cromosomas homólogos durante la anafase I. En la segunda división meiótica se separan cromátidas hermanas tras la liberación de la cohesión entre cinetocoros hermanos. La fusión de los gametos de distinto sexo restaura finalmente el número cromosómico diploide de la especie e inicia el desarrollo cigótico. La cohesión de cromátidas hermanas durante la meiosis es esencial para mantener unidos los cinetocoros hermanos en metafase I, permitiendo que, tras la liberación de las cohesinas en los brazos cromosómicos, segreguen cromosomas homólogos en la anafase I. Además la cohesión en meiosis se requiere para la formación de estructuras cromosómicas como el complejo sinaptonémico e incluso para el desarrollo de la recombinación meiótica y el intercambio de material genético entre cromosomas homólogos. En este contexto se plantea la presente Tesis Doctoral, cuyo principal objetivo es el estudio de las interrelaciones existentes entre la recombinación meiótica, la sinapsis y la cohesión de cromátidas hermanas. Nos hemos interesado especialmente por la dinámica y localización de diferentes subunidades del complejo de cohesina a lo largo de la meiosis. Además, hemos analizado la relación de la secuencia temporal existente entre el inicio de la recombinación y la sinapsis, estudiando el papel de las cohesinas en ambos procesos. Todos estos fenómenos se suceden y coordinan en los cromosomas durante las diferentes etapas de la meiosis. Puesto que la estructura y organización de los cromosomas cambia a lo largo de las divisiones meióticas, e influye en todos estos procesos, otro de nuestros objetivos ha sido el análisis de la estructura del cromosoma meiótico relacionada con la localización del complejo de cohesina y con la historia sináptica de cada cromosoma. Para nuestro propósito hemos utilizado un modelo clásico en estudios citogenéticos, los saltamontes. Concretamente hemos analizado la meiosis masculina de tres especies: Locusta migratoria, Eyprepocnemis plorans y Stethophyma grossum. Todas ellas muestran un complemento cromosómico que comprende 22 autosomas y un determinismo cromosómico del sexo XX en las hembras y X0 en los machos. Este último factor nos ha permitido estudiar el comportamiento de un univalente natural, el cromosoma X. Además, algunos individuos de la especie Eyprepocnemis plorans presentan cromosomas accesorios, también llamados cromosomas B, caracterizados por no formar parte del complemento A de la especie ni interaccionar con ellos, aunque algunos de ellos podrían haber evolucionado a partir del cromosoma X. Seleccionando individuos con un único cromosoma B, hemos podido estudiar otro tipo de univalente natural durante la meiosis. Por su parte, los machos de la especie Stethophyma grossum, muestran sinapsis incompleta y localización proximal de los quiasmas en 8 de sus 11 bivalentes. En conjunto, entre las tres especies hemos estudiado el comportamiento de bivalentes con sinapsis completa, de bivalentes con sinapsis incompleta que presentan localización de quiasmas y de univalentes como el cromosoma X o los cromosomas accesorios. Para abordar los objetivos planteados en esta Tesis Doctoral e intentar aportar nuevos datos para esclarecer la localización del complejo de cohesina, su incorporación y liberación en meiosis, además de intentar conocer su papel en situaciones de restricción de sinapsis y recombinación, hemos estudiado la dinámica y localización de diferentes subunidades del complejo de cohesina: SMC3, SMC1¿, RAD21 y SA1. La inmunodetección de SMC3 y SMC1¿ durante la profase I nos ha permitido analizar el progreso de la sinapsis. Además hemos analizado la localización de dos proteínas implicadas en el inicio de la recombinación: ¿-H2AX y RAD51 y una modificación histónica, la trimetilación de la histona 3 en la lisina 9 (H3K9me3), la cual se relaciona con heterocromatina en mamíferos. La detección de las proteínas ha sido realizada mediante inmunofluorescencia indirecta, utilizando anticuerpos específicos sobre aplastados y esparcidos de espermatocitos. El aplastado de espermatocitos es una técnica que permite mantener el volumen celular y la estructura cromosómica, mostrándose como una herramienta muy útil a la hora de estudiar la localización de las proteínas y su relación espacial y estructural en el cromosoma meiótico y entre sí. El análisis de las diferentes subunidades del complejo de cohesina en la profase I de saltamontes indica una incorporación secuencial de las mismas, encontrando que SMC3 y SMC1¿ se visualizan en forma de ejes en profase I desde leptotena y es sólo al comienzo de cigotena cuando se incorporan RAD21 y SA1 a los cromosomas, coincidiendo en el espacio y en el tiempo con el progreso de la sinapsis. Posteriormente, en cromosomas condensados de metafase I, detectamos que ambos grupos de subunidades del complejo de cohesina, las SMC y las no SMC, RAD21 y SA1, están presentes en el dominio intercromatídico de regiones cromosómicas que han presentado sinapsis en paquitena, aunque no colocalizan completamente. Sin embargo, hemos observado que las subunidades no SMC estudiadas están ausentes en el dominio intercromatídico de univalentes y regiones cromosómicas que no han presentado sinapsis durante la profase I. Por lo tanto hemos relacionado la presencia de determinadas subunidades del complejo de cohesina en cromosomas en metafase I con su historia sináptica en la profase I previa, infiriendo que la presencia de determinadas subunidades del complejo de cohesina en el dominio intercromatídico de los cromosomas estaría estrechamente relacionada con el ensamblaje del complejo sinaptonémico. Por otro lado, hemos observado que la liberación de las distintas subunidades del complejo de cohesina estudiadas se produce también de forma gradual. En este sentido, mientras que el marcaje de RAD21 se pierde completamente en la transición metafase I ¿ anafase I, SMC3 y SMC1¿ persisten hasta telofase I en regiones centroméricas y detectamos únicamente SA1 hasta telofase II en los cinetocoros. De todos estos datos hemos inferido que en la meiosis de los machos de saltamontes debe existir más de un tipo de complejo de cohesina. En relación a la estructura cromosómica en meiosis, discutimos la posición de las cohesinas y hemos generado un posible modelo de trabajo donde proponemos una recolocalización de los complejos de cohesina desde una posición exclusivamente a nivel de base de los bucles de cromatina en paquitena, hacia una posición que englobaría gran parte de la superficie de contacto entre las dos cromátidas hermanas en metafase I. Por otro lado se ha realizado un estudio relativo a la relación temporal existente entre los procesos de inicio de la recombinación y el comienzo de la sinapsis entre los cromosomas homólogos. Actualmente se conocen dos modelos a este respecto, el primero está presente en ratón, humanos, Arabidopsis thaliana y levaduras, donde los fenómenos de inicio de la recombinación son previos y necesarios para la correcta formación del complejo sinaptonémico. En el segundo modelo, la sinapsis es previa al inicio de la recombinación y lo encontramos en Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans. Nuestras investigaciones en saltamontes, realizadas mediante el estudio de la subunidad de cohesina SMC3, estrechamente relacionada con los elementos axiales de los cromosomas, y las proteínas ¿-H2AX y RAD51 implicadas en el inicio de la recombinación, nos han permitido inferir que la recombinación en saltamontes comienza antes que la sinapsis, lo que implica que este tipo de insectos seguirían un modelo similar al observado en ratón, humanos, levaduras y Arabidopsis thaliana entre otros. Los datos previos relativos a la meiosis de los machos de Stethophyma grossum describen la presencia de sinapsis parcial y restricción en la localización de quiasmas en 8 de sus bivalentes. Hemos analizado la evolución de los ejes de cohesina durante la profase I y hemos observado una polarización en la maduración de dichos ejes, distinguiéndose dos regiones nucleares, una más avanzada que la otra. Nuestros datos además apuntan a que las regiones avanzadas en la maduración del eje de SMC3 son las únicas donde se produce sinapsis. En los estudios que hemos realizado de las proteínas de inicio de la recombinación en esta especie, mostramos que las roturas programadas de doble cadena de ADN están restringidas a las regiones avanzadas en la maduración del eje de cohesina en las primeras etapas de la profase I. Además, en esta especie hemos realizado un estudio de la localización de la modificación histónica H3K9me3. Nuestras observaciones al respecto muestran que las roturas de doble cadena en el ADN se producen de forma restringida sobre regiones de cromatina donde está presente dicha modificación. Por lo tanto, este modelo de trabajo nos permite relacionar una maduración diferencial de eje de cohesina en los cromosomas con una restricción de los lugares donde se producen las roturas de doble cadena y la posterior sinapsis de cromosomas homólogos. Además, estos fenómenos se polarizan en el núcleo y se relacionan con H3K9me3. Para profundizar en las relaciones existentes entre todos estos fenómenos, hemos realizado un tratamiento con rayos gamma con el fin de generar de forma generalizada roturas de doble cadena exógenas en el ADN. Nuestros resultados muestran que el sistema, a pesar de sufrir roturas de doble cadena generalizadas en toda la cromatina, no es capaz de cambiar su patrón de restricción sináptica, ni de localización de quiasmas entre cromosomas homólogos. Además hemos detectado que RAD51, una recombinasa implicada en reparación de daño genético, se incorpora preferiblemente sobre las regiones donde está presente la variante H3K9me3, aunque el daño en el ADN haya sido generalizado. En resumen, en esta Tesis Doctoral aportamos evidencias citológicas de la posible existencia de diferentes complejos de cohesina en la meiosis de saltamontes y relacionamos la presencia y ausencia de distintas subunidades de cohesina con la historia sináptica de cada cromosoma. En cuanto a la relación temporal entre el inicio de la recombinación y la sinapsis, relacionamos a los saltamontes con modelos como el de ratón, humanos, levaduras y A. thaliana, diferenciándose de D. melanogaster. Además consideramos de vital importancia la maduración del eje de cohesina para el correcto progreso de fenómenos como la recombinación meiótica y la sinapsis y conferimos un papel especial a la organización nuclear y a la composición de la cromatina en la incorporación de proteínas de reparación.