Amplificación génica y resistencia a metotrexato en l. Trópica

Abstract

El trabajo ha consistido en caracterizar los mecanismos moleculares de resistencia al farmaco metotrexato (mtx) en dos lineas de l. Tropica. Por un lado se ha analizado el comportamiento que sigue una poblacion heterogenea en respuesta a seleccion con mtx, que revelo la existencia de un elevado grado de polimorfismo en el patron cromosomico entre los individuos de la poblacion salvaje y los que se seleccionaban en presencia de farmaco. Este polimorfismo afectaba incluso al patron de proteinas y mas concretamente al de la proteina dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa (dhfr-ts), blanco de accion del farmaco. Esta proteina diferia entre ambas poblaciones tanto en la localizacion cromosomica como en su secuencia nucleotidica y de aminoacidos a unos niveles comparables a los que mostraban dos proteinas procedentes de dos especies diferentes de leishmania. Una caracterizacion cinetica de la dhfr-ts recombinante de ambas poblaciones revelo que no se encontraban modificados los parametros cineticos entre ellas ni tampoco afectaban las modificaciones aminoacidicas a la interaccion con el inhibidor mtx. Por otro lado, cuando la induccion de la resistencia se hizo partiendo de una linea clonada, el cariotipo molecular se mantuvo homogeneo en las lineas resistentes comparado con el de la linea salvaje. El fenomeno que caracterizaba a la linea resistente era la presencia de amplificacion genica, tanto en forma de elementos extracromosomicos lineales como circulares, derivados del locus h. Todos los amplicones contenian el gen de la pteridina reductasa que esta directamente implicado en conferir resistencia a mtx. La caracterizacion estructural de los diferentes amplicones revelo que todos contenian una duplicacion invertida del locus h original, habiendo intervenido en la generacion de todos ellos los mismos sitios de recombinacion.