Terapia celular aplicada a la regeneración del estroma corneal uso de las células madre del tejido adiposo en modelos experimentales

Resumen

ÍNDICE...........................................................................................................................1 ABREVIATURAS ........................................................................................................... 6 RESUMEN Y SUMMARY ............................................................................................. 8 INTRODUCCIÓN........................................................................................................12 1 CÉLULAS MADRE: APLICACIÓN CLÍNICA EN MEDICINA REGENERATIVA...... 13 1.1 El origen de las células madre....................................................................... 15 1.2 Fuentes de células madre.................................................................................. 16 1.3 Células madre adultas: transdiferenciación ................................................. 18 1.4 Las células madre mesenquimales adultas ............................................... 19 1.5 Las células madre derivadas de tejido adiposo como agente terapéutico .... 20 2 LA TERAPIA CELULAR Y SU IMBRICACIÓN EN LA BIO-INGENIERÍA TISULAR.................................. 22 3 DIFERENTES APROXIMACIONES TERAPÉUTICAS EN EL TRANSPLANTE CORNEAL ........................ 25 4 AVANCES EN TERAPIA CELULAR EN OFTALMOLOGÍA ........................... 27 4.1 Tipos de células madre en el ojo................................................................ 27 4.1.1 Células madre epiteliales corneales. ................................................... 27 4.1.2 Células madre estromales corneales: ................................................. 27 4.1.3 Células epiteliales del cristalino: ................................................................... 28 4.1.4 Células madre conjuntivales epiteliales: ......................................................... 28 4.1.5 Células progenitoras retinianas:.................................................................... 28 4.2 Aplicación clínica ................................................................................................. 28 5 OBJETIVO: EL ESTROMA CORNEAL ......................................................................................................... 30 5.1 Estructura del tejido estromal corneal.............................................................. 31 5.1.1 Células. ............................................................................................................ 31 5.1.2 Matriz extracelular................................................................................................ 31 5.2 Candidato celular del estudio ......................................................................... 32 OBJETIVOS...................................................................................................................34 MATERIAL Y MÉTODOS ...........................................................................................36 6 AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN IN VITRO DE LA POBLACIÓN CELULAR DE LPA........... 37 6.1 Procesamiento del tejido adiposo humano: obtención de la población celular LPA............. 37 6.2 Caracterización de las células LPA en cultivo ............................................... 38 6.3 Detección in vitro de la expresión de colágeno por inmunofluorescencia ............. 40 6.4 Inmunodetección in vitro de la expresión de queratocan y ALDH ............ 41 6.5 Capacidad de transdiferenciación por parte de las células LPA............... 42 6.5.1 Inducción de diferenciación en linaje condrogénico.................................... 42 Índice 6.5.2 Inducción de diferenciación en linaje osteogénico.................................... 43 7 PREPARACIÓN DE LAS CÉLULAS LPA PARA SU TRANSPLANTE IN VIVO...... 43 7.1 Aislamiento y cultivo de las células LPA ........................................................ 43 7.2 Marcaje celular y recolección....................................................................... 43 7.3 Inducción de quiescencia y análisis por citometría de flujo .................................................. 44 8 MODELO EXPERIMENTAL DE TRANSPLANTE CELULAR SOBRE CÓRNEAS NO LESIONADAS PARA ESTUDIOS DE BIOSEGURIDAD, RECHAZO INMUNE, SUPERVIVENCIA E INTEGRACIÓN.. 44 8.1 Procedimiento quirúrgico .............................................................................. 45 8.2 Observación clínica ............................................................................................. 48 8.3 Obtención del tejido para el análisis ..................................................................................... 48 9 MODELO EXPERIMENTAL DE TRANSPLANTE CELULAR EN CÓRNEAS LESIONADAS, TALLADAS MEDIANTE ABLACIÓN LASER: ESTUDIOS DE SUPERVIVENCIA Y REGENERACIÓN CORNEAL48 9.1 Procedimiento quirúrgico ....................................................................... 48 9.2 Observación clínica ........................................................................................... 50 9.3 Obtención del tejido para el análisis ..................................................................................... 51 10 ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA Y FUNCIONALIDAD DE LAS CELULAS LPA TRANSPLANTADAS IN VIVO........................................................................................... 51 10.1 Exámen histológico y localización de las células LPA en el estroma corneal..... 51 10.2 Tinción inmunohistoquímica del colágeno I, III, IV y VI ................................. 52 10.3 Tinción inmunohistoquímica del proteoglicano queratocan y la enzima ALDH ................... 52 10.4 Determinación por RT-PCR de la expresión del mRNA de queratocan humano................... 53