Importancia del infiltrado inflamatorio y la neovascularización asociada al melanoma y su correlación con el desarrollo de metástasisEstudio inmunohistoquímico de 81 casos. Árboles de decisión basados en “Machine learning”

Zusammenfassung

TÍTULO TESIS Importancia del infiltrado inflamatorio y la neovascularización asociada al melanoma y su correlación con el desarrollo de metástasis: Estudio inmunohistoquímico de 81 casos. Árboles de decisión basados en “Machine learning” INTRODUCCIÓN El melanoma es un tumor derivado de los melanocitos. A pesar de que representa un 2- 3% de todos los tumores malignos de piel, supone la causa más frecuente de muerte por cáncer cutáneo. En los últimos años se ha incrementado su incidencia, no así su mortalidad, probablemente debido a un diagnóstico más precoz y en estadios iniciales. Se estima que la incidencia se ha incrementado un 3-7% cada año durante los últimos 50 años en la raza blanca. Su incidencia aumenta a un ritmo mayor que el de la mayoría de los tumores sólidos, siendo un tumor potencialmente muy agresivo que afecta a una población cada vez más joven. Los últimos hallazgos en la genética, la inmunología y el tratamiento de melanoma hacen que haya pasado de ser un tumor con mal pronóstico cuando es invasivo a una prolongación significativa de la esperanza de vida de estos pacientes. Por todo ello la investigación en este tumor continúa siendo de vital importancia en el momento actual. La respuesta inmune a los tumores sólidos entre los que se encuentra el melanoma está cobrando cada vez más importancia por las implicaciones pronósticas que tiene y los posibles tratamientos inmunodirigidos. La forma de estudiar esta respuesta inmune es muy variada y una forma de hacerlo es mediante el estudio del infiltrado inflamatorio asociado a los mismos. El infiltrado inflamatorio en los tumores fue descrito por primera vez por Virchow en 1863 y se pensaba entonces que el cáncer se originaba en sitios de inflamación crónica y el tumor crecía debido a este proceso inflamatorio. Sin embargo, pronto se observó que no era que el infiltrado inflamatorio fuera el origen del cáncer sino al contrario, las células del sistema inmunitario del huésped aparecían como un mecanismo de defensa frente al tumor y su presencia se relacionaba con un mejor pronóstico. En el caso del melanoma, el estudio del infiltrado inflamatorio se lleva realizando desde hace años y es bien conocida su importancia pronóstica y como marcador de respuesta a los nuevos tratamientos inmunoterápicos. La composición del TIL es heterogénea y engloba no solamente linfocitos T reguladores (Treg) sino otras muchas células como linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, células naturales Killer (NK), macrófagos, células dendríticas y células supresoras derivadas de la médula ósea, entre otras. El conocimiento del fenotipo y función de estas células es imprescindible para el estudio del microambiente tumoral y los posibles tratamientos dirigidos a estos. Por otro lado, la angiogénesis y linfangiogénesis juegan un papel fundamental en el desarrollo de las metástasis del melanoma y la progresión del mismo. En los últimos años numerosos estudios han investigado la importancia clínica y como factor pronóstico de estos fenómenos y el desarrollo de nuevas técnicas moleculares ha llevado a un mejor conocimiento de la angiogénesis/linfangiogénesis en el melanoma. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Es por tanto fundamental realizar trabajos de investigación sobre los marcadores que nos permitan identificar a los pacientes que van a desarrollar dichas metástasis. Recientemente se ha utilizado el término de “endofenotipo” para nombrar/identificar aquellos marcadores propios de cada individuo que pueden relacionarse en estos casos con el desarrollo de metástasis. En los últimos años se han adquirido relevancia dos aspectos fundamentales en el desarrollo de las mismas: el sistema inmune y la neovascularización. Con esta base nos planteamos el estudio del infiltrado inflamatorio acompañante del melanoma mediante el análisis de los distintos componentes del mismo utilizando técnicas de inmunohistoquímica (CD3, CD4, CD8, FOXP3, CD40, GZMB) y el análisis de la neovascularización mediante el estudio de los vasos en el TIL en dos series de pacientes con melanoma metastásico y no metastásico. Y apoyándonos en la inteligencia artificial en su rama de “Machine Learning” crear árboles de decisión que nos permitieran con los datos de endofenotipo de nuestros pacientes predecir cuáles van a desarrollar metástasis y cuáles no. Objetivos: a) Describir las características clínicas y anatomopatológicas de nuestra serie de pacientes con melanoma metastásico y no metastásico. b) Describir las características inmunohistoquímicas del infiltrado inflamatorio acompañante de los melanomas primarios metastásicos y no metastásicos. c) Comparar las características inmunohistoquímicas del infiltrado inflamatorio asociado a tumor (TIL) de los melanomas primarios metastásicos con las de los no metastásicos. d) Describir la densidad de vasos (endoteliales y linfáticos) asociados al tumor en los melanomas primarios metastásicos y en la de los no metastásicos. e) Comparar la densidad de vasos tumorales entre los melanomas primarios metastásicos con la de los no metastásicos. f) Creación de árboles de decisión basados en “Machine learning” que nos permitan, a partir de características anatomopatológicas y de IHQ, predecir qué pacientes van a desarrollar metástasis y cuáles no. MATERIAL Y MÉTODOS Se plantea un estudio retrospectivo de casos y controles analíticos, con análisis de muestras del servicio de anatomía patológica del Hospital Puerta de Hierro (Majadahonda, Madrid) entre los años 2000-2020 de melanomas cutáneos primarios metastásicos y de melanomas primarios no metastásicos diagnosticados en este hospital. No se tomaron nuevas muestras de pacientes ni se realizaron procedimientos invasivos. Selección casos y controles En el estudio se recogen 2 series de melanomas. La primera serie, está constituida por 40 melanomas cutáneos metastásicos (incluyéndose metástasis ganglionares y viscerales), cuyas muestras histológicas se conservan en el archivo del Servicio de Anatomía Patológica de dicho hospital. Se incluyen todos los casos diagnosticados en ese periodo de los cuales se tiene material anatomopatológico tanto del primario como de las metástasis subsecuentes. • Criterios de inclusión: 1) Diagnóstico histológico de melanoma cutáneo y diagnóstico histológico de metástasis ganglionar o visceral. 2) Disponibilidad de muestra histológica tanto del primario como de las metástasis subsecuentes. 3) Seguimiento clínico y disponibilidad de la información clínico-patológica. • Criterios de exclusión: 1) Melanoma de localización extra-cutánea. Se excluyeron los melanomas coroideos y los melanomas de mucosas. 2) Metástasis de melanomas de las que no se disponía del melanoma primario. 3) Melanomas primarios de los cuales no se disponía de material anatomopatológico de las metástasis. 4) Tamaño del tumor insuficiente para la realización de las técnicas del estudio. La segunda serie incluye 41 melanomas cutáneos no metastásicos diagnosticados entre enero 2010 y enero 2020, cuyas muestras histológicas se conservan en el archivo del Servicio de Anatomía Patológica de dicho hospital. Se seleccionaron los controles en ese periodo de tiempo de manera aleatoria de manera que cumplieran los siguientes criterios de inclusión: 1) Melanoma cutáneo con diagnóstico histológico de melanoma con índice de Breslow > 1 mm al que se le ha realizado ganglio centinela siendo este negativo y que durante el periodo de seguimiento no ha desarrollado metástasis. 2) Melanomas de los que se disponía de la muestra histológica del melanoma primario. 3) Seguimiento clínico y disponibilidad de la información clínico-patológica. Criterios de exclusión: 1) Melanomas cutáneos a los que se realizó ganglio centinela con un índice de Breslow < 1 mm. 2) Melanomas cutáneos a los que se realizó ganglio centinela con índice de Breslow > 1 mm que fueron positivos. 3) Melanomas cutáneos a los que se realizó ganglio centinela con índice de Breslow > 1 mm y que desarrollaron progresión metastásica de la enfermedad en el periodo de seguimiento. 4) Melanomas cutáneos de los que no se disponía de la muestra histológica (por proceder de otro centro u otras causas). 5) Melanomas con regresión histológica completa. 6) Melanomas coroideos o de mucosas. Se recogen variables demográficas, clínicas, anatomopatológicas y de seguimiento de forma retrospectiva y se realizan estudios inmunohistoquímicos en muestras histológicas disponibles en el servicio de anatomía patológica del hospital. Una vez seleccionados los pacientes, se revisaron las historias clínicas de todos ellos y se recogieron los datos de interés que se detallan en la tesis así como su evolución. Las 81 muestras se procesaron de manera similar en el servicio de anatomía patológica de este hospital. Los datos recogidos de todas las variables clínicas, histológicas y de inmunohistoquímica se incluyeron en una base de datos (Microsoft Excel). Se ha realizado un estudio a doble ciego. Los datos de los pacientes que pertenecían a cada grupo (metastásicos y no metastásicos) fueron codificados. La persona que evaluó las imágenes de la histopatología e hizo las medidas de las variables estudiadas no conocía a qué grupo pertenecía cada paciente. La persona que llevó a cabo el estudio estadístico tampoco sabía qué grupo era cada uno. Sólo tras terminar el análisis estadístico se rompió la codificación. El estudio estadístico fue realizado con el paquete estadístico R 4.0.1. (R Core Team, 2020). Las variables que se expresan en proporciones se describen numéricamente como porcentajes y en gráficas como histogramas. Los datos continuos se describen numéricamente como media y desviación estándar, y en gráficas como mediana, rango intercuartil y extremos. Para comparar los dos grupos (metastásicos y no metastásicos) se han realizado dos estudios estadísticos. El primero ha consistido en un análisis univariante, mediante una prueba Chi cuadrado para comparar proporciones en las variables sexo, localización BANS, ganglio centinela, positivo/negativo, linfadenectomía, estado último seguimiento, tipo de melanoma primario, regresión, TIL, nevus previo, invasión linfática, invasión vascular, invasión perineural, metástasis ganglionares y metástasis viscerales; mientras que las variables numéricas como el índice de Breslow y edad al diagnóstico del melanoma primario han sido comparadas con la prueba t de Student. El segundo análisis ha utilizado las técnicas de Machine Learning Árboles de Regresión y Clasificación (Classification and Regression Trees – CART) y Bosques Aleatorios (Random Forests) para buscar patrones que permitieran clasificar los pacientes en los dos grupos (metastásicos y no metastásicos). Para estudiar los CART se ha usado la función rpart del paquete estadístico rpart de Therneau y Atkinson. El número mínimo de observaciones por nodo para intentar una partición ha sido de 15. Los árboles de clasificación y de regresión se dibujaron con la función rpart.plot del paquete rpart.plot de Milborrow. Los datos también fueron analizados con el paquete estadístico randomForest para R de Liaw y cols. Este paquete selecciona de forma aleatoria el 66,7% de los resultados como muestra de aprendizaje (learning sample en inglés) para fabricar un árbol de clasificación con esos datos. En 96 este caso se consideró que cada nodo debía tener al menos 5 casos. El resto de los datos (33,3% de los resultados, llamados en estadística “datos fuera de la bolsa” (out-of-bag) se emplean para determinar la sensibilidad y especificidad del árbol de clasificación. Este proceso genera un árbol de clasificación cada vez, proceso que fue repetido 1000 veces. El proceso de repetición se llama en inglés bootstrap RESULTADOS: 1.-Ánálisis univariante separando el grupo de los melanomas metastásicos y los no metastásicos: En el grupo de los melanomas metastásicos observamos que 26 pacientes (65%) son varones y 14 mujeres (35%) con una edad media al diagnóstico del tumor primario de 61,5 años. En 24 pacientes (60%) el melanoma estaba localizado en una zona no clasificada de alto riesgo (no BANS). En este grupo de pacientes se realizó ganglio centinela en 19 pacientes (47,5%) y fue positivo en 13 de ellos (68,4%) realizándose linfadenectomía en 18 pacientes (45%) y no realizándose en 22(55%). En cuanto al estado del último seguimiento disponible 15 pacientes (37,5%) habían fallecido por melanoma, 6 (15%) por otras causas y 12 (30%) continuaban vivos en el momento del análisis. Si nos fijamos en el estudio histológico en este grupo, el tipo de melanoma primario fue en 2 pacientes (5%) de LMM, en 11 (27%) un MES, en 6 (15%) un MLA y 17 (42,5%) un MN. La media del espesor de Breslow fue de 5 mm, se objetivó regresión histológica en 14 pacientes (35%), invasión linfovascular en 3 pacientes (7,5%) e invasión perineural en 5 (12,5%). En 8 pacientes (20%) se identificó nevus asociado. En cuanto al infiltrado inflamatorio asociado al tumor (TIL), fue catalogado como ausente en 11 pacientes (27,5%), como enérgico en 9 (22,5%) y como no enérgico en 20 (50%). En la evolución, 32 pacientes (80%) desarrollaron metástasis ganglionares en el tiempo de seguimiento y 24 (60%) metástasis viscerales. En el grupo de los melanomas no metastásicos, 12 pacientes (29,3%) eran varones y 29 mujeres (70 %). En cuanto a la localización del melanoma primario en 16 pacientes (39%) estaba localizado en zonas catalogadas como de alto riesgo y en 25 (61%) en otras áreas. La edad media en este grupo fue de 63,6 años. A todos los pacientes de este grupo se les realizó ganglio centinela siendo negativo en todos ellos (se consideraba criterio de inclusión). En el último seguimiento ninguno de los pacientes había fallecido por el melanoma, 1 paciente había fallecido por otras causas (un accidente de tráfico), en 5 pacientes (12,2%) habíamos perdido el seguimiento y 35 pacientes (85,4%) estaban vivos en el momento del análisis. Si nos fijamos en el melanoma primario, 7 pacientes (17,1%) tenían un LMM, 24 pacientes (58,5%) un MES, 2 pacientes un MLA (4,9%) y 8 (19,5%) un MN. La media del índice de Breslow en este grupo fue de 2,2 mm. En cuanto a otras características histológicas, no observamos regresión histológica en 20 pacientes (48,8%) y sí en 21(51,2%). Observamos nevus previo en 3 pacientes (7,3%) mientras que en 38 pacientes (92,7%) no lo encontramos. Se objetivó invasión linfática en 2 pacientes (4,9%), invasión vascular en 1 paciente (2,4%) e invasión perineural también en 1 paciente (2,4%). Centrándonos en el infiltrado inflamatorio asociado al tumor (TIL), en 6 pacientes (14,63%) fue catalogado como ausente, en 26 pacientes (63,4%) como enérgico y en 9 pacientes (22%) como no enérgico. En el tiempo de seguimiento no se observó desarrollo de metástasis viscerales ni ganglionares 2.- Comparación de las poblaciones linfocitarias en los grupos metastásico y no metastásico Centrándonos en el estudio de las poblaciones linfocitarias vemos que en el grupo de los metastásicos hay una expresión de CD3 catalogada como alta en 28 pacientes (36,4%) en comparación con 39 pacientes (50%) en el grupo de los melanomas no metastásicos, y aunque se observa en el grupo de los no metastásicos una mayor expresión de CD3, en nuestra serie las diferencias encontradas no fueron estadísticamente significativas p=0,121. En cuanto a la expresión de CD4, si comparamos ambos grupos, sí encontramos diferencias estadísticamente significativas con p<0,001. También encontramos diferencias marcadas estadísticamente significativas en cuanto a la expresión de CD8, de tal manera que en el grupo de metastásicos encontramos una expresión de CD8 alta en 12 pacientes (15,8%) y baja en 64 pacientes (84,2%) mientras que en el grupo de los no metastásicos vemos una expresión alta en 45 pacientes (57%) y baja en 34 (43%). Las diferencias son especialmente marcadas en cuanto a la expresión de este marcador IHQ en ambos grupos. En la expresión de CD20 y FOXP3 no encontramos diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos. Si nos fijamos en la expresión de PD1 también encontramos diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos, de tal manera que la expresión de PD1 es alta en un 29% de los metastásicos en comparación con una expresión alta de PD1 en el 14% de los no metastásicos. En cuanto a la neovascularización, evaluada mediante la expresión de CD31 encontramos en el grupo de los metastásicos una media de 16,9 vasos por campo evaluado en comparación con 9,4 en el grupo de los no metastásicos con diferencias estadísticamente significativas. Sin embargo, al evaluar la densidad de vasos linfáticos, no encontramos diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos. 3.- Árboles y bosques de clasificación En nuestro análisis de estos dos grupos nos preguntamos si con toda esta información de las poblaciones linfocitarias y la vascularización en nuestra muestra de pacientes podríamos clasificarlos a priori como metastásicos o no metastásicos, es decir si realizando el análisis de CD3, CD4, CD8, FOXP3, CD20, CD31 y D2-40 en las muestras de los melanomas primarios podríamos predecir si van a desarrollar metástasis o no. Para esto, en la segunda parte del análisis estadístico utilizamos las técnicas de inteligencia artificial de Machine Learning Árboles de Regresión y Clasificación (Classification and Regression Trees – CART) y Bosques Aleatorios (Random Forests). Estas engloban un conjunto de técnicas supervisadas no paramétricas que consiguen segmentar el espacio de los predictores en regiones simples, dentro de las cuales es más sencillo manejar las interacciones y predecir la variable respuesta. CONCLUSIONES 1) Los melanomas primarios metastásicos tienen un TIL catalogado como ausente o “no enérgico “en la mayoría de los casos estudiados. 2) Los melanomas primarios no metastásicos tienen un TIL catalogado como “enérgico” en la mayoría de los casos estudiados. 3) El infiltrado inflamatorio asociado al tumor en nuestra serie de melanomas está compuesto en su mayoría por linfocitos T (CD3, CD4 y CD8) siendo muy escasos los linfocitos B o las células NK. 4) El TIL en los melanomas metastásicos tiene una expresión de CD4 y CD8 catalogada como baja en la mayoría de los casos, mientras que los melanomas no metastásicos tienen una expresión de CD4 y CD8 catalogada como alta en la mayoría de los casos. 5) La expresión de PD1 es mayor en el infiltrado inflamatorio asociado al tumor en los melanomas metastásicos que en el TIL de los melanomas no metastásicos, en nuestra serie. 6) En los melanomas metastásicos encontramos un incremento de vasos sanguíneos en comparación con los melanomas no metastásicos, sin embargo, no encontramos diferencias en el número de vasos linfáticos. 7) Si nos apoyamos en las técnicas de “Machine learning” los marcadores de IHQ que mayor relevancia tienen a la hora de predecir si un paciente va a desarrollar metástasis o no son el índice de Breslow, la cuantificación de vasos sanguíneos mediante CD31 y la cantidad de linfocitos T citotóxicos cuantificada mediante expresión con CD8.