Estudio de la interacción de la proteína p6 con el dna del bactriófago phi29 de bacillus subtilis

Resumen

Estudio de la interacción de la proteína p6 con el DNA del bactriófago phi29 de Bacillus subtilis. La proteína p6 del bacteriófago phi29 de Bacillus subtilis es esencial para el desarrollo del fago. Activa la iniciación de la replicación del DNA y promueve el paso de la transcripción temprana a la tardía. Estas actividades requieren la formación de un nucleocomplejo proteico en el cual el DNA forma una superhélice dextrógira alrededor de un núcleo proteico. Sin embargo, no existe evidencia de la unión de la proteína p6 al DNA de phi29 in vivo. En este trabajo, la unión de la proteína p6 al DNA se ha estudiado mediante la técnica de entrecruzamiento e inmunoprecipitación de cromatina (X-ChIP) y posterior amplificación de secuencias específicas mediante PCR cuantitativa. Los resultados han indicado que p6 se une a la mayoría del genoma viral in vivo, aunque con mayor afinidad a los extremos del DNA, donde se localizan los orígenes de replicación. La unión de p6 a las diferentes regiones del DNA de phi29 esta modulada por las propiedades estructurales de las secuencias nucleotídicas, y la mayor afinidad por ambos extremos esta probablemente relacionada con la presencia de secuencias cuyas propiedades de curvabilidad favorecen la formación del complejo p6-DNA. La unión de p6 a lo largo del genoma de phi29 sugiere fuertemente que las funciones de esta proteína en replicación y transcripción pueden ser propiedades integradas en una función más global, actuando a modo de proteína tipo histone-like. Además, la proteína p6 se une con mayor afinidad al DNA de phi29 con respecto al DNA plasmídico. Esta especificidad puede ser debida a la preferencia de p6 por unirse a DNA superenrollado menos negativamente. Por lo que la dependencia del estado topológico que presenta la unión de p6 puede explicar su unión preferencial al DNA viral con respecto al DNA plasmídico o bacteriano, que presentarían niveles de superenrollamiento negativo mayores que los encontrados en el DNA de phi29. La unión de p6 al DNA de phi29 se incrementa enormente en presencia de novobiocina. El hecho de que la girasa celular se requiera para la replicación viral indica que, aunque el DNA de phi29 no se encuentra cerrado covalentemente, si se encuentra topológicamente restringido. Las proteínas virales p1 y p17 se requieren para el mantenimiento de una correcta topología del DNA viral. También se estudiado la unión in vivo de la proteína p6 del fago GA-1, relacionado con phi29. Esta proteína ha mostrado una dependencia de superenrollamiento en su interacción con el DNA mucho menor que la descrita para la proteína p6 de phi29. Además aunque la p6 de GA-1 es capaz de unirse al DNA de phi29 in vivo, no es capaz de transcomplementar una mutación sin sentido en el gen 6 de phi 29. indicando que el nucleocomplejo formado en el sistema heterólogo no es funcional. La capacidad de la proteína p6 para unirse a DNA a permitido su empleo como sonda para poder monitorizar el proceso de inyección del DNA viral. Con esta aproximación, se ha podido comprobar que la proteína viral de membrana p16.7 se requiere, junto con la proteína p17, para el desarrollo eficiente de la segunda etapa de la inyección. Finalmente, se ha caracterizado cuantitativamente in vitro la heteroasociación p6-DNA en solución, en términos de estequiometría, afinidad y cooperatividad, empleándose para ello la técnica de ultracentrifugación analítica. Este análisis ha mostrado que la formación del complejo p6-DNA puede ser ajustada a la función empírica de Hill. También se ha analizado el efecto de la aglomeración macromolecular en la formación del complejo p6-DNA mediante equilibrio de sedimentación.